siRNA抑制TAK1基因?qū)A滑膜細(xì)胞Aggrecanase-1表達(dá)的影響.pdf

1、目的
　　 代培養(yǎng)RA(rheumatoid arthritis;類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎)滑膜細(xì)胞,獲取高純度滑膜成纖維細(xì)胞,轉(zhuǎn)特異性的siRNA染入RA滑膜成纖維細(xì)胞內(nèi),給予炎性刺激因素干預(yù),探討是否能降低RA滑膜成纖維細(xì)胞Aggrecanase-1表達(dá)水平,及siRNA技術(shù)在RA基因治療中的可行性。
　　 方法
　　 收集類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人膝關(guān)節(jié)置換術(shù)中病變的類風(fēng)濕性滑膜組織,采用酶消化法進(jìn)行體外滑膜細(xì)胞的分離培養(yǎng)并傳

2、至3-5代,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài),通過(guò)免疫組化鑒定。定制siRNA轉(zhuǎn)染試劑及轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)劑,制備可靠的特異性siRNA,將RA滑膜成纖維細(xì)胞分為四組,分別為轉(zhuǎn)染TAK1-siRNA細(xì)胞組(實(shí)驗(yàn)組),錯(cuò)配堿基陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照細(xì)胞組、GAPDH-siRNA陽(yáng)性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組(對(duì)照組)。轉(zhuǎn)染后對(duì)各組進(jìn)行IL-1β干預(yù),收集各組細(xì)胞上清液,ELISA方法比較各組Aggrecanase-1(聚蛋白多糖酶-1)的釋放量。
　　 結(jié)果<

3、br>　　 該實(shí)驗(yàn)4例患者的滑膜細(xì)胞標(biāo)本均采用體外消化培養(yǎng)法成功培養(yǎng),平均傳代至3～5代,細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較好,比較穩(wěn)定,大約傳至第7代時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)減慢,出現(xiàn)老化狀態(tài)。免疫組化鑒定滑膜細(xì)胞均一地表達(dá)Vimetin(＞95%)、表明所培養(yǎng)的細(xì)胞是滑膜成纖維細(xì)胞。檢測(cè)炎性刺激后實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比Aggrecanase-1含量有明顯的差異,呈現(xiàn)出組間差異,表明通過(guò)抑制TAK1可降低Aggrecanase-1表達(dá)水平,以降低對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的損傷。