應(yīng)用siRNA抑制星形細(xì)胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白基因后對(duì)GFAP表達(dá)的影響.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)旨在經(jīng)體外分離、培養(yǎng)來純化獲得的星形膠質(zhì)細(xì)胞，并導(dǎo)入以膠質(zhì)纖維酸性蛋白基因的不同位點(diǎn)為靶標(biāo)的3條siRNA誘導(dǎo)膠質(zhì)纖維酸性蛋白mRNA基因沉默，通過觀察細(xì)胞形態(tài)變化及檢測(cè)細(xì)胞GFAP表達(dá)改變，來分析應(yīng)用siRNA技術(shù)抑制靶基因后對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，以期為抑制脊髓損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞過度活化，并為進(jìn)一步研究解決SCI后瘢痕過度增生、清除脊髓軸突再生障礙，從而促進(jìn)神經(jīng)軸突損傷修復(fù)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 研究方法：分離1周內(nèi)新生SD大鼠

2、大腦皮層細(xì)胞，用含20﹪血清的DMEM/F12的培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)原代及傳代培養(yǎng)，并以GFAP-FITC免疫熒光法對(duì)所獲細(xì)胞進(jìn)行鑒定。待傳代培養(yǎng)生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)良好時(shí)，隨機(jī)將其分為6組(空白對(duì)照、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、3種不同的siRNA各對(duì)應(yīng)一組，分別為S1/S2/S3組)，進(jìn)行特異性siRNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，并對(duì)細(xì)胞形態(tài)的變化進(jìn)行觀察記錄、應(yīng)用GFAP-FITC免疫熒光法對(duì)各組AS進(jìn)行檢測(cè)；收集各組細(xì)胞應(yīng)用Western-blott

3、ing檢測(cè)GFAP的表達(dá)。 研究結(jié)果：轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞體積較空白組細(xì)胞體積減小，細(xì)胞突起減少或變短，增長(zhǎng)趨勢(shì)在一定程度上被遏制；免疫熒光法顯示轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)的GFAP熒光明顯較空白組減弱；Western-blotting檢測(cè)表明，轉(zhuǎn)染后24h星形膠質(zhì)細(xì)胞的GFAP表達(dá)較空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組明顯下調(diào)(P＜0.05)。 研究結(jié)論：體外分離培養(yǎng)可獲得純度較高的星形膠質(zhì)纖維細(xì)胞；在應(yīng)用siRNA轉(zhuǎn)染后，星形膠質(zhì)纖維細(xì)胞的體積較轉(zhuǎn)染前