泛素相關(guān)蛋白樣因子2在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及可能機(jī)制探討.pdf

1、背景: 前列腺癌是常見(jiàn)的男性惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，目前前列腺癌是全世界男性第二大最常見(jiàn)的癌癥。在歐美國(guó)家，前列腺癌的致死率在美國(guó)僅次于肺癌。雖然迄今為止，我國(guó)前列腺癌發(fā)病率仍遠(yuǎn)低于歐美發(fā)達(dá)國(guó)家，但隨著社會(huì)的發(fā)展，環(huán)境污染、飲食結(jié)構(gòu)西方化及人口老齡化等因素的作用，前列腺癌的發(fā)病率在我國(guó)正在呈逐年上升趨勢(shì)在我國(guó)，已成為危害老年男性生命健康的重要疾病。大多數(shù)前列腺癌患者對(duì)雄激素阻斷治療(androgen deprivation

2、 therapy, ADT)初期有較好的治療效果，即雄激素依賴性，但這個(gè)“有效期”平均僅能維持6-18個(gè)月，幾乎所有的患者最終轉(zhuǎn)為雄激素非依賴性，這一臨床階段缺乏有效的治療方法，平均生存期一般不超過(guò)18個(gè)月。到目前為止，前列腺癌發(fā)生的潛在機(jī)制并不十分清楚。近年來(lái)，針對(duì)泛素-蛋白酶體通路的研究顯示，該通路與腫瘤的生長(zhǎng)息息相關(guān)，通過(guò)抑制劑阻斷該通路被認(rèn)為有效的治療腫瘤的方法，并且一些有效的抑制劑已經(jīng)在臨床上用于治療腫瘤。泛素相關(guān)蛋白樣因子2

3、(Ubiquitin associated protein2-like，UBAP2L)是一種可與泛素結(jié)合的分子，且研究顯示，在抑制劑阻斷蛋白酶體途徑后，UBAP2L可共定位于泛素化的蛋白聚集區(qū)，提示UBAP2L可能與泛素-蛋白酶體途徑相關(guān)，參與人體細(xì)胞病理生理過(guò)程。事實(shí)上，有報(bào)道指出，UBAP2L作為成骨細(xì)胞蛋白的一種，可在翻譯后被糖基化修飾，從而參與了骨骼形成。也有報(bào)道顯示，UBAP2L存在于人精子蛋白中，可與人卵細(xì)胞中的ZP3(Zo

4、na Pellucida-3)蛋白交聯(lián)，從而阻止精子與卵子的結(jié)合，在生殖系統(tǒng)疾病中扮演潛在的作用，由此也可推測(cè)，同樣作為泌尿生殖系統(tǒng)疾病之一，人類(lèi)前列腺癌或許與UBAP2L這個(gè)神秘的分子息息相關(guān)。然而，對(duì)于泛素相關(guān)蛋白樣因子2在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的有關(guān)作用及機(jī)制研究尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　目的: 通過(guò)建立穩(wěn)定敲除泛素相關(guān)蛋白樣因子2(UBAP2L)基因的前列腺癌細(xì)胞系（PC-3和DU145細(xì)胞），來(lái)探究泛素相關(guān)蛋白樣因子2在前列腺癌發(fā)生

5、和發(fā)展過(guò)程中的作用，揭示UBAP2L與前列腺癌的細(xì)胞生長(zhǎng)、腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系，闡明UBAP2L在促進(jìn)前列腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過(guò)蛋白芯片技術(shù)，觀察UBAP2L引起的常見(jiàn)信號(hào)通路的改變，試求探討UBAP2L促進(jìn)前列腺癌發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制。
　　方法: 選取常見(jiàn)的前列腺癌細(xì)胞系（PC-3細(xì)胞，DU145細(xì)胞，LN-Cap細(xì)胞和22RV1細(xì)胞），從mRNA和蛋白水平分別檢測(cè)UBAP2L的RNA和蛋白表達(dá)水平，得出UB

6、AP2L在常見(jiàn)前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)譜。并從中選取2種細(xì)胞系（本課題選取PC-3和DU145細(xì)胞），采用慢病毒包裝，將特異性敲除UBAP2L基因的shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入2種細(xì)胞系，以構(gòu)建穩(wěn)定敲除UBAP2L基因的前列腺癌細(xì)胞系模型。模型成功建立后，分別在第1、2、3、4、5天行MTT法，檢測(cè)正常前列腺癌細(xì)胞系和敲除UBAP2L的細(xì)胞系在相同條件下的腫瘤細(xì)胞增殖能力。再用集落形成實(shí)驗(yàn)觀察敲除UBAP2L的細(xì)胞系較正常細(xì)胞系的細(xì)胞集落形成率的

7、差別;流式細(xì)胞儀檢測(cè)敲除UBAP2L后細(xì)胞周期的改變;用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)UBAP2L對(duì)前列腺癌細(xì)胞系的遷移能力的影響;Pathscan intracellular signaling array蛋白芯鋅片技術(shù)用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路活化情況，以期提示UBAP2L可能的作用機(jī)制。
　　結(jié)果: 1.UBAP2L在選取的4種前列腺癌細(xì)胞系里均有表達(dá)，但表達(dá)量有差別，表現(xiàn)為在PC-3細(xì)胞和DU145細(xì)胞內(nèi)的RNA和蛋白水平較穩(wěn)定，

8、而在LN-Cap細(xì)胞和22RV1細(xì)胞內(nèi)，RNA和蛋白水平不一致，其中22RV1尤其明顯。2.共轉(zhuǎn)慢病毒和包裝質(zhì)粒后，細(xì)胞內(nèi)熒光含量達(dá)90％以上。3.與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染了慢病毒介導(dǎo)的特異性敲除UBAP2L基因的shRNA后，UBAP2L的mRNA和蛋白水平均顯著降低(p＜0.01)。4.與對(duì)照組相比，UBAP2L敲除組細(xì)胞增殖能力明顯下降(p＜0.01)，細(xì)胞集落形成率減低(p＜0.01);G0/G1期細(xì)胞比例明顯下降，S期細(xì)胞比例明顯升

9、高(p＜0.01)。5.與對(duì)照組相比，敲除UBAP2L的前列腺癌細(xì)胞系PC-3和DU145的遷移能力明顯下降(p＜0.01)。6.Pathscan intracellular signaling array顯示UBAP2L敲除后，BAD、AMPKα和PRAS40信號(hào)通路被阻滯。
　　結(jié)論: 綜上所述，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示，泛素相關(guān)蛋白樣因子2在前列腺癌不同細(xì)胞系中存在差異表達(dá)。泛素相關(guān)蛋白蛋白樣因子2在前列腺癌的生長(zhǎng)和遷移中發(fā)揮作用