HBV X基因及其產(chǎn)物對(duì)成人肝細(xì)胞HL-7702線粒體結(jié)構(gòu)和功能的影響.pdf

1、目的：研究乙型肝炎病毒(HBV)X基因及其產(chǎn)物HBx與HBx結(jié)合蛋白細(xì)胞色素C氧化酶Ⅲ(COX Ⅲ)的相互作用及其對(duì)線粒體結(jié)構(gòu)和功能的影響。 方法將HBV X基因真核表達(dá)載體pcDNA3-X及空載體pcDNA3轉(zhuǎn)染成人肝細(xì)胞HL-7702細(xì)胞，經(jīng)過2周G418篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)的新細(xì)胞株，分別命名為HL-7702/HBx和H-7702/pcDNA3，RT-PCR和Western blot方法證實(shí)HBVx基因在HL-7702/HB

2、x細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá)。抽提細(xì)胞總RNA進(jìn)行半定量RT-PCR及分離細(xì)胞線粒體進(jìn)行Western blot檢測(cè)COX Ⅲ表達(dá)水平變化。通過酶動(dòng)力學(xué)方法檢測(cè)線粒體細(xì)胞色素氧化酶活性，羅丹明123熒光染色法檢測(cè)線粒體跨膜電位及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，Western blot方法比較各組細(xì)胞NF-κB和c-myc表達(dá)水平的差別。 結(jié)果：重組質(zhì)粒pcDNA3-X轉(zhuǎn)染后經(jīng)G418篩選，RT-PCR和Western-blot分析結(jié)果顯示

3、HL-7702/HBx細(xì)胞能夠穩(wěn)定表達(dá)HBV X基因。RT-PCR和Western-blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBV X基因下調(diào)COX Ⅲ蛋白表達(dá)而不影響mRNA水平表達(dá)。酶動(dòng)力學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)線粒體細(xì)胞色素C氧化酶活性降低，同時(shí)線粒體跨膜電位也發(fā)現(xiàn)下降，而細(xì)胞內(nèi)ROS水平?jīng)]有發(fā)生明顯改變。Western blot結(jié)果表明與氧化應(yīng)激相關(guān)的蛋白c-myc表達(dá)下調(diào)，而NF-κB表達(dá)不發(fā)生變化。 結(jié)論HBV X基因通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)COX Ⅲ表達(dá)，H