P2X-,7-受體在少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的表達(dá)、功能效應(yīng)及在缺氧缺血性腦損傷中作用的初步研究.pdf

1、圍產(chǎn)期缺氧缺血(hypoxia ischemia，HI)是造成新生兒腦損傷的首要原因。尤其在早產(chǎn)兒形成一種區(qū)別于足月兒和成年人的獨(dú)特病變--擇性腦白質(zhì)損傷。病理改變包括腦室周?chē)踪|(zhì)軟化(periventricular leukomalacia，PVL)和彌散性腦室周?chē)踪|(zhì)損傷(periventricular white matter injury，PWMI)。后者發(fā)生率為前者10倍，以髓鞘減少或髓鞘形成延遲為主要病理特征。近年來(lái)，隨著新

2、生兒救護(hù)技術(shù)的提高，早產(chǎn)兒存活率顯著增加，PWMI及由此產(chǎn)生的遠(yuǎn)期神經(jīng)學(xué)后遺癥發(fā)生率明顯上升，給家庭和社會(huì)造成巨大負(fù)擔(dān)。少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(oligodendrocytc precursor cells，OPCs)損傷是PWMI形成的主要原因和中心環(huán)節(jié)。未成熟腦白質(zhì)中對(duì)缺氧缺血高度敏感的OPCs的大量死亡以及分化發(fā)育障礙是PWMI形成的關(guān)鍵。因此，深入研究OPCs缺氧缺血性損傷機(jī)制，是闡明早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷機(jī)理，尋找預(yù)防和治療藥物，降低早產(chǎn)

3、兒死亡率和致殘率的重要途徑。迄今為止，對(duì)OPCs缺氧缺血損傷機(jī)制所知有限，可能與谷氨酸興奮毒性、炎癥介質(zhì)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載等多種因素有關(guān)。然而針對(duì)這些機(jī)制的干預(yù)措施并未轉(zhuǎn)化為臨床治療成果。 ATP是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，通過(guò)激活嘌呤能受體P2X和P2Y發(fā)揮多種作用。P2X7R是嘌呤能受體P2X家族中非常獨(dú)特的一個(gè)亞類(lèi)，為雙功能受體，主要在病理?xiàng)l件下活化?，F(xiàn)有的研究表明，P2X7R在膠質(zhì)細(xì)胞具有廣泛多樣的效應(yīng)，對(duì)病理狀

4、態(tài)下多個(gè)信號(hào)通路具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，提示P2X7R可能處于神經(jīng)膠質(zhì)信號(hào)過(guò)程中相當(dāng)上游的調(diào)節(jié)位點(diǎn)，通過(guò)調(diào)節(jié)遞質(zhì)釋放、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和增殖，在膠質(zhì)變性及隨后的修復(fù)過(guò)程中起重要作用。被認(rèn)為是缺血再灌注損傷，Alzheimer’s病，脊髓損傷和神經(jīng)性疼痛等疾病潛在的治療靶點(diǎn)。 對(duì)于P2X7R在神經(jīng)膠質(zhì)病理中的作用，至今還有許多未涉足的領(lǐng)域。新近報(bào)道P2XTR拮抗劑能改善疾病模型中的O4+少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和脫髓鞘病變，提示P2X7R在

5、少突膠質(zhì)系細(xì)胞損傷過(guò)程中可能具有重要作用。然而目前對(duì)于P2X7R與OPCs的關(guān)系尚所知甚少。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，離體培養(yǎng)的OPCs呈P2X7R免疫陽(yáng)性。那么，OPCs表達(dá)的P2X7R是否具有功能?受體活化產(chǎn)生什么樣的生物學(xué)效應(yīng)?是否參與OPCs缺氧缺血性損害或防御過(guò)程?為解決這些問(wèn)題，首先，我們?cè)谠兣囵B(yǎng)的OPCs上檢測(cè)P2X7R表達(dá)和功能效應(yīng)；其次，觀測(cè)氧葡萄糖剝奪后P2X7R在OPCs表達(dá)的變化以及激動(dòng)劑、拮抗劑對(duì)OPCs缺氧缺血

6、性損傷的干預(yù)效應(yīng)；第三，為在更完整的系統(tǒng)中了解受體表達(dá)，建立P3大鼠缺氧缺血性腦損傷模型，觀察P2X7R在正常未成熟腦組織不同腦區(qū)的表達(dá)及HI后的變化。得出如下結(jié)果： 一、少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定 1.混合膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)采用機(jī)械分離法；以振蕩分離法和差速貼壁法分離純化OPCs；加入促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活的營(yíng)養(yǎng)因子N2及促進(jìn)增殖的細(xì)胞因子PDGFa和bFGF，獲得數(shù)量較多的OPCs，通過(guò)NG2鑒定，培養(yǎng)細(xì)胞純度在90％以上，

7、并且具有向成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的潛能。OPCs分離純化的完成為以O(shè)PCs為研究對(duì)象的實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)和保障。 2.采用膜片鉗技術(shù)證明OPCs具有獨(dú)特電生理特性：輸入阻抗(Ra)相對(duì)較高；電壓依賴(lài)的K+電流具有外向整流特性；對(duì)TTX敏感的小的內(nèi)向Na+流，不能產(chǎn)生動(dòng)作電位。電生理特性測(cè)定也是對(duì)OPCs進(jìn)行鑒定的可靠方法之一。 二、P2X7R在少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的表達(dá)以及受體活化后的功能效應(yīng) 1.通過(guò)RT-PCR、West

8、ern blot和免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)，從基因和蛋白水平證明離體培養(yǎng)的OPCs表達(dá)P2X7R； 2.100μM BzATP誘導(dǎo)[Ca2+]i顯著升高，藥理學(xué)特性與P2X7R符合：用含EGTA的無(wú)鈣溶液可以顯著降低鈣反應(yīng)振幅，提示[Ca2+]i升高依賴(lài)于細(xì)胞外Ca2+，該效應(yīng)由P2X受體介導(dǎo)；BzATP(100μM)誘導(dǎo)的鈣信號(hào)平均振幅顯著高于ATP(100μM)；100nM BBG預(yù)處理幾乎完全抑制BzATP誘導(dǎo)的鈣反應(yīng)。說(shuō)明在激動(dòng)

9、劑刺激下，P2X7R活化介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流，使得[Ca2+]i升高。 3.染料負(fù)載實(shí)驗(yàn)中，300μM BzATP刺激，OPCs的熒光光密度較對(duì)照明顯增加，300nM BBG預(yù)孵育可顯著抑制此效應(yīng)。提示高濃度BzATP誘導(dǎo)離體培養(yǎng)OPCs形成高通透性的質(zhì)膜孔道，這一過(guò)程由P2X7R介導(dǎo)。 4.BzATP(100μM)刺激后，OPCs培養(yǎng)基中LDH釋放量顯著升高，提示BzATP對(duì)OPCs具有細(xì)胞毒性效應(yīng)，造成急性細(xì)胞損傷。BB

10、G(10.nM)預(yù)孵育明顯抑制BzATP引起的LDH釋放量升高，提示BBG可以明顯減輕BzATP的細(xì)胞毒性效應(yīng)，增加細(xì)胞存活。 三、P2X7R在少突膠質(zhì)前體細(xì)胞缺氧缺血性損傷中作用的初步研究 1.OGD后2 h，近40％OPCs死亡。OGD前預(yù)先給予BBG(100nM)起到部分保護(hù)作用；OGD條件下，BzATP加重OPCs缺氧缺血性損傷，并且這種增強(qiáng)的毒性作用不能被BBG拮抗。提示OPCs對(duì)HI十分敏感；P2X7R特異性

11、濃度的BBG對(duì)OPCs缺氧缺血性損傷具有部分保護(hù)效應(yīng)，提示P2X7R活化參與OGD造成的OPCs損害； 2.RT-PCR和Westernblot顯示，OGD后2h，P2XTRmRNA和蛋白表達(dá)迅速下調(diào)，從另一個(gè)角度提示P2X7R可能在OPCs缺氧缺血性損害過(guò)程中發(fā)揮作用。 四、P2X7R在新生大鼠腦組織的表達(dá)及在缺氧缺血性腦損傷后的變化 1.Western blot分析顯示，由P0～P28，大鼠海馬、皮層、白質(zhì)P

12、2X7R蛋白表達(dá)呈上升趨勢(shì)。 2.通過(guò)RT-PCR、Western blot分析，從基因和蛋白水平證明P3大鼠海馬、皮層、白質(zhì)表達(dá)P2X7R；免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)顯示在海馬、皮層和白質(zhì)，部分NG2+ OPCs表達(dá)P2X7R；同時(shí)，皮層、海馬有大量P2X7R免疫陽(yáng)性神經(jīng)元，主要表達(dá)于細(xì)胞胞體。 3.P3大鼠單側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎，吸入8％氧2h建立缺氧缺血性腦損傷模型，HI后2h，患側(cè)海馬、皮層和白質(zhì)P2X7R免疫反應(yīng)均減弱，P2X

13、TRmRNA和蛋白水平迅速下調(diào)；胼胝體NG2+/P2X7R+細(xì)胞數(shù)量減少。HI后P2X7R表達(dá)下調(diào)，提示P2X7R可能參與未成熟腦組織缺氧缺血性損傷過(guò)程，但其具體作用和機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。 本實(shí)驗(yàn)首先建立離體純培養(yǎng)OPCs模型，證明OPCs表達(dá)功能性P2X7R，受體活化介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流，質(zhì)膜孔道形成和OPCs死亡。離體培養(yǎng)的OPCs對(duì)OGD高度易損，P2X7R拮抗劑BBG能明顯減輕OPCs缺氧缺血性損傷。缺氧缺血后早期，離體