大鼠急性腦缺血后CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞、TGF-β1的表達及其相關性研究.pdf

1、缺血性腦卒中即為廣義的腦梗塞，是指突然發(fā)生的腦組織局部供血動脈血流灌注減少或血流完全中斷，停止供血、供氧、供糖等，使該局部腦組織崩解破壞。缺血性腦卒中成為當今世界成年人死亡和致殘的主要原因之一，其高死亡率、高致殘率越來越受到人們關注。在眾多治療腦梗死的措施中，溶栓治療是唯一被認為確切有效的辦法，但由于其治療時間窗較短和高出血風險，限制了其在臨床的運用。研究發(fā)現(xiàn):在局灶性腦缺血后較長時間內(nèi)腦損傷仍進行性加重，腦缺血組織周邊存在明顯炎性免疫

2、反應，其輕重與缺血后神經(jīng)損害程度密切相關。甚至Acalovschi等認為:在腦缺血急性期，缺血區(qū)炎性反應對腦組織的損傷要比缺血本身更為嚴重。另一種觀點指出，缺血性腦卒中后由于血-腦屏障破壞和組織破壞致使腦的抗原表位暴露給免疫系統(tǒng)，從而可造成自身免疫性損傷。有研究指出:提前誘導對神經(jīng)系統(tǒng)抗原鞘磷脂堿蛋白(MBP)的免疫耐受可抑制神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫反應，而且可以改善腦卒中結(jié)果。通常認為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中“促炎反應”具有神經(jīng)破壞作用，而“抑炎反應

3、”具有神經(jīng)保護作用。抑制腦缺血后的“炎性免疫反應”或“自身免疫反應”可能會成為今后治療和改善急性腦缺血損傷的重要靶點，然而目前關于腦缺血后炎性免疫反應的機制尚未完全闡明，特別是急性腦缺血后的“抑炎反應”的研究目前仍較少，因此有必要對腦缺血后炎癥免疫反應的調(diào)控機制行進一步的探討。
　　 調(diào)節(jié)性T細胞(Treg細胞)是一批具有獨特免疫調(diào)節(jié)功能的T細胞亞群，以調(diào)劑自身T細胞反應為主要功能，此類細胞同時具有免疫無能性和免疫抑制功能兩大特

4、征。它能夠抑制自身反應性T細胞的表達、阻止自身免疫性疾病的發(fā)生、免疫無能、維持自身免疫耐受等，在維持外周免疫耐受和抑制炎癥反應發(fā)生中具有不可替代的作用。其中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞為目前研究較為深入的Treg細胞，目前認為該群細胞最具特異的標志是叉頭翼螺旋轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，其在CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的產(chǎn)生和功能發(fā)揮方面都起到?jīng)Q定性的作用。研究指出TGF-β1是有CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞分泌產(chǎn)生的一種具有免疫抑制作用

5、的細胞因子，同時TGF-β1在誘導CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的產(chǎn)生和維持作用的發(fā)揮中起關鍵作用。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)高表達TGF-β1轉(zhuǎn)基因小鼠的外周血和胸腺中CD4+CD25+T細胞的表達增加，體外研究指出將TGF-β1與CD4+CD25+T細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)能增強CD4+CD25+T細胞的免疫抑制性功能。
　　 近年來Treg細胞已在自身免疫疾病、腫瘤、器官移植、病毒性感染等疾病領域中已經(jīng)展開了廣泛的研究，尤其是CD4+CD25+

6、調(diào)節(jié)性T細胞已經(jīng)成為目前研究的熱點話題。然而就目前國內(nèi)外研究狀況而言，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞在缺血性腦卒中方面的的研究較少。已知腦缺血組織周邊存在明顯炎性反應，是加重腦缺血損傷的原因之一。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞是一種具有免疫抑制作用的細胞，那么CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞是否參與急性腦缺血的發(fā)生發(fā)展？具體作用是什么目前仍不太清楚。研究已經(jīng)指出TGF-β1能誘導體內(nèi)外CD4+CD25+T細胞的表達及作用的發(fā)揮，那么在腦缺

7、血發(fā)生發(fā)展的病理演變過程中，TGF-β1是否同樣與CD4+CD25+T細胞的表達息息相關呢？
　　 目的:
　　 動態(tài)觀察大鼠急性腦缺血后不同時期外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞和TGF-β1的表達情況，探討二者之間的相關性，觀察腦缺血灶病理形態(tài)學特征，同時觀察腦組織中Foxp3的表達與腦缺血灶形成的關系以及外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的表達與神經(jīng)功能損傷的相關性，以探討CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞在急

8、性缺血性卒中病理生理演變過程中的作用以及調(diào)節(jié)通路。
　　 48只Wistar大鼠按隨機數(shù)字表法分為腦缺血組和假手術(shù)組，每組各24只。參考改良的Zea-Longer插線方法將缺血組大鼠制作成右側(cè)大腦中動脈線栓腦缺血動物模型。分別采用流式細胞術(shù)和ELISA法檢測造模后1d、3d、7d、14d時大鼠外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞和TGF-β1的表達情況，采用HE染色觀察腦缺血灶病理形態(tài)學特征，采用免疫組化法觀察兩組大鼠腦組織中

9、Foxp3的表達，同時采用改良NSS神經(jīng)功能缺損評分觀察兩組大鼠行為學變化，并做CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞與TGF-β1、NSS之間的相關分析。
　　 結(jié)果:
　　 1、流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，急性腦缺血后的1d、3d、7d、14dCD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的表達有逐漸增高趨勢，在這4個時間點中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的表達只有1d、3d差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，其它時間均有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.05

10、)。外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的表達在腦缺血后的1d、3d時與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，到7d、14d時其表達明顯高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 2、ELISA法結(jié)果顯示，外周血中TGF-β1的表達在腦缺血后的1d時與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，到3d時其表達開始較假手術(shù)組增高(P＜0.05)，到7d、14d時其表達明顯高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學學意義(P

11、＜0.05);急性腦缺血后的1d、3d、7d、14dTGF-β1的表達同樣有逐漸增高趨勢，且各個時間點相互之間的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 3、HE染色顯示，缺血組大鼠腦組織可見梗死灶，呈典型的缺血性改變，神經(jīng)元胞體縮小，胞核固縮、深染，病變部位與周圍組織界線清楚，壞死中心區(qū)可見大量神經(jīng)細胞缺血壞死，神經(jīng)元外形不易辨認，大部分細胞結(jié)構(gòu)消失，胞漿空泡樣變性，神經(jīng)細胞數(shù)目明顯減少，壞死灶內(nèi)大量膠質(zhì)細胞增生。假手術(shù)組大鼠

12、腦組織中神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未見明顯的病理性損傷。
　　 4、免疫組化染色結(jié)果顯示，在腦缺血后的1d、3d、7d、14d的腦組織中均可觀察到Foxp3的表達，且主要集中在缺血灶及周邊區(qū)域，在腦缺血組的未缺血區(qū)域也可以觀察到Foxp3的表達，而假手術(shù)組腦組織未形成缺血灶，未見Foxp3的表達。
　　 5、神經(jīng)功能評分結(jié)果顯示，兩組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分差異在腦缺血后的1d、3d、7d、14d均有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01

13、)。
　　 6、相關分析顯示，急性腦缺血后的1d、3d、7d、14dTGF-β1的表達逐漸增多，與CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的表達呈正相關(r=0.822，p=0.000);各個時間點的相關分析顯示，除在腦缺血后1d時CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞與TGF-β1的表達無顯著相關之外，余各個時間點均存在正相關關系:1d(r=0.9757，p=0.138)、3d(r=0.921,p=0.027)、7d(r=0.886,p=0.0

14、45)、14d(r=0.920,p=0.027);隨著腦缺血時間延長，急性腦缺血后的神經(jīng)功能評分均逐漸下降，與CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的表達呈負相關(r=-0.820，p=0.01)，各個時間點的相關分析顯示:CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的表達與神經(jīng)功能缺損評分在腦缺血后的1d、3d、7d、14d均存在負相關關系:1d(r=-0.885，p=0.019)、3d(r=-0.878,p=0.022)、7d(r=-0.690,p=0.

15、029)、14d(r=-0.911,p=0.012)。
　　 結(jié)論:
　　 1、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞在急性腦缺血后的不同時期存在著動態(tài)變化，提示CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞參與大鼠急性腦缺血后病理生理的發(fā)生發(fā)展過程。
　　 2、腦缺血后可出現(xiàn)神經(jīng)元胞體縮小，胞核固縮、深染、大量神經(jīng)細胞缺血壞死，神經(jīng)元外形不易辨認，大部分細胞結(jié)構(gòu)消失，胞漿空泡樣變性，神經(jīng)細胞數(shù)目明顯減少，壞死灶內(nèi)大量膠質(zhì)細胞增生等現(xiàn)象

16、。
　　 3、腦組織中Foxp3的表達與腦缺血灶的形成密切相關，F(xiàn)oxp3的表達嚴格集中在梗塞灶及周邊區(qū)域，提示CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞參與腦組織的缺血損傷和修復過程。
　　 4、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的表達與神經(jīng)功能損傷程度呈負相關，提示CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞在急性腦缺血后的免疫調(diào)節(jié)中可能具有保護作用。
　　 5、TGF-β1在急性腦缺血后的不同時期同樣存在著動態(tài)變化，且與CD4+CD25