CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特異標(biāo)志物FOXP3在慢性乙型肝炎中的作用及其與TGF-β1的相關(guān)性.pdf

1、目的：目前認(rèn)為CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg cell)是機(jī)體免疫系統(tǒng)維持免疫耐受的重要調(diào)節(jié)者，可能參與乙型肝炎病毒感染慢性化的過(guò)程。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)是目前已知的最重要的致纖維化因子，它的激活介導(dǎo)了多種組織纖維化的產(chǎn)生，同時(shí)其作為一種重要的免疫抑制因子在免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要的免疫抑制的作用。本課題通過(guò)觀察慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中FOXP3 mRNA和血清TGF-β1的表達(dá)水平，以及FOXP

2、3和TGF-β1蛋白在活檢肝組織中的表達(dá)及定位情況，分析二者與病理炎癥活動(dòng)度、肝纖維化分期、轉(zhuǎn)氨酶、病毒載量等指標(biāo)的關(guān)系，并分析FOXP3和TGF-β1之間相關(guān)性。進(jìn)一步探討CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在CHB中的特性及作用機(jī)制，從而為CHB免疫耐受建立的主動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)制提供有力證明，并為研究慢性乙型肝炎發(fā)病機(jī)制和治療方法提供理論依據(jù)。
　　方法：⑴病例選擇：入選120例病例均為慢性乙型肝炎患者，其中男86例，女34例，年齡16～6

3、9歲，平均年齡35.8±14.3歲。所有患者血清學(xué)指標(biāo)均HBsAg陽(yáng)性，HBeAg或抗-HBe陽(yáng)性，HBV DNA陽(yáng)性或陰性。診斷符合2005年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)、感染病學(xué)分會(huì)制定的《慢性乙型肝炎防治指南》標(biāo)準(zhǔn)[4]。以炎癥活動(dòng)度分級(jí)(G)進(jìn)行分組，其中G1組30例，G2組33例，G3組29例，G4組28例；設(shè)立正常對(duì)照組(G0)16例，正常肝組織來(lái)源于肝血管瘤術(shù)后。入選病例都排除甲、丙、丁、戊型病毒性肝炎重疊感染，排除藥物性肝炎、自

4、身免疫性肝病、脂肪肝、酒精性肝病等其它肝病。入選病例無(wú)肝穿活檢禁忌、血小板計(jì)數(shù)均>70×109，凝血酶原活動(dòng)度＞60％。⑵實(shí)驗(yàn)方法：于肝穿刺活檢前兩日，抽取患者空腹靜脈血，進(jìn)行乙肝五項(xiàng)、肝功能、HBVDNA定量、凝血酶原活動(dòng)度(PTA)、TGF-β1檢測(cè)。同時(shí)收集肝穿患者外周EDTA抗凝血2ml，淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，提取單個(gè)核細(xì)胞的RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄cDNA，real-time PCR技術(shù)擴(kuò)增檢測(cè)FOXP3mRNA。所選病例均

5、進(jìn)行肝臟活體組織穿刺檢查，分別進(jìn)行HE、Masson、網(wǎng)織纖維染色，并進(jìn)行炎癥活動(dòng)度分級(jí)(G)和纖維化分期(S)；免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)不同炎癥活動(dòng)度分級(jí)及纖維化分期患者外周血單個(gè)核細(xì)胞及肝組織中FOXP3及TGF-β1的表達(dá)變化及定位特點(diǎn)。應(yīng)用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：①FOXP3在不同炎癥分級(jí)的表達(dá)變化：G0級(jí)，F(xiàn)OXP3不表達(dá)或僅見(jiàn)于個(gè)別散在于匯管區(qū)及肝竇內(nèi)的淋巴細(xì)胞表達(dá)；G1和G2級(jí)，肝組織匯管

6、區(qū)可見(jiàn)到少量至中等量FOXP3陽(yáng)性表達(dá)的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；G3和G4級(jí)，在肝組織匯管區(qū)可見(jiàn)到中等量至大量FOXP3陽(yáng)性表達(dá)的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。②TGF-β1在不同炎癥分級(jí)的表達(dá)變化：G0期未見(jiàn)明顯染色陽(yáng)性物質(zhì)，極小部分偶在肝竇間隙可見(jiàn)陽(yáng)性物質(zhì)；G1、G2期染色陽(yáng)性物質(zhì)主要分布于肝血竇壁及竇周細(xì)胞，炎癥壞死灶及匯管區(qū)；G3、G4期在纖維間隔和肝細(xì)胞中均有分布，且著色深；G4期肝細(xì)胞、炎癥壞死區(qū)內(nèi)染色陽(yáng)性物質(zhì)尤為顯著。③不同病理分級(jí)CHB外周血單個(gè)

7、核細(xì)胞中FOXP3 mRNA水平均高于正常對(duì)照組(G0)(P＜0.05)，隨著炎癥活動(dòng)度的逐漸增加，F(xiàn)OXP3 mRNA表達(dá)水平逐漸增強(qiáng)，與炎癥活動(dòng)度呈正相關(guān)(r＝0.811，P＜0.05)。④不同病理分級(jí)CHB外周血單個(gè)核細(xì)胞中TGF-β1表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組(G0)(P＜0.05)，隨著炎癥活動(dòng)度的逐漸增加，TGF-β1表達(dá)水平逐漸增強(qiáng)，與炎癥活動(dòng)度呈正相關(guān)(r=0.769，P＜0.05)。⑤不同纖維化分期CHB外周血單個(gè)核細(xì)胞

8、中FOXP3 mRNA表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組(S0期)(P＜0.05)，F(xiàn)OXP3 mRNA表達(dá)水平與纖維化程度無(wú)相關(guān)性(r=0.228，P＞0.05)。⑥不同纖維化分期CHB外周血單個(gè)核細(xì)胞中TGF-β1表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組(S0期)(P＜0.05)，隨著纖維化分期逐漸增加，TGF-β1表達(dá)水平逐漸增強(qiáng)，與纖維化程度呈正相關(guān)(r＝0.704，P＜0.05)。⑦不同病理分級(jí)CHB肝組織中FOXP3評(píng)分均高于正常對(duì)照組(G0組)(P

9、＜0.05)，隨著炎癥活動(dòng)度的逐漸增加，F(xiàn)OXP3評(píng)分逐漸增強(qiáng)，與炎癥活動(dòng)度呈正相關(guān)(r=0.866，P＜0.05)。⑧不同病理分級(jí)CHB肝組織中TGF-β1評(píng)分均高于正常對(duì)照組(G0組)(P＜0.05)，隨著炎癥活動(dòng)度的逐漸增加，TGF-β1評(píng)分逐漸增強(qiáng)，與炎癥活動(dòng)度呈正相關(guān)(r＝0.841，P＜0.05)。⑨不同纖維化分期CHB肝組織中FOXP3評(píng)分均高于正常對(duì)照組(S0組)(P＜0.05)，F(xiàn)OXP3評(píng)分與纖維化程度無(wú)相關(guān)性(r＝

10、0.312，P＞0.05)。⑩在肝組織中的FOXP3表達(dá)與ALT、HBV DNA定量之間無(wú)相關(guān)性。
　　結(jié)論：⑴CHB患者外周血單個(gè)核細(xì)胞及肝臟中Foxp3的表達(dá)隨著炎癥活動(dòng)度的逐漸增加表達(dá)也逐漸增強(qiáng)，尤其以匯管區(qū)的表達(dá)更為顯著，與炎癥活動(dòng)度之間呈正相關(guān)。肝臟炎癥的存在是促進(jìn)FOXP3分泌表達(dá)的必要條件。FOXP3可作為判斷乙型肝炎的病情和預(yù)后的指標(biāo)之一，但以肝組織中FOXP3表達(dá)更能客觀反映炎癥活動(dòng)程度。⑵CHB患者血清及肝組織