胃癌患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的臨床及實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、胃癌是全世界最常見的惡性腫瘤，世界范圍內(nèi)胃癌的年發(fā)病率為17.6/10萬人。1993年第二次全國腫瘤死亡(1990-1993)抽樣調(diào)查，在高死亡率的惡性腫瘤中胃癌仍占第一位。因此在我國胃癌的診治及研究工作的任務(wù)顯得尤為突出。胃癌的治療強(qiáng)調(diào)的是綜合治療，首選手術(shù)治療。進(jìn)展期胃癌即使施以根治性切除，但由于亞臨床轉(zhuǎn)移灶的存在，仍有較高的腫瘤復(fù)發(fā)率。對于中晚期胃癌患者來說，五年生存率平均只有20％左右。目前正在尋求新的治療方法改善預(yù)后。

2、 惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與宿主的免疫狀態(tài)密切相關(guān)，現(xiàn)代免疫學(xué)已證明腫瘤免疫主要由T細(xì)胞介導(dǎo)。目前大多數(shù)腫瘤患者未能產(chǎn)生令人滿意的抗腫瘤效應(yīng)，主要是存在腫瘤特異的免疫逃脫機(jī)制(immumologicalevasionstrategies)。腫瘤的免疫逃脫機(jī)制主要有免疫系統(tǒng)不能識別的抗原以及免疫抑制造成的腫瘤特異性T細(xì)胞數(shù)量減少和功能缺陷。目前腫瘤的免疫治療的研究重點(diǎn)集中在打破免疫耐受和提高宿主的T細(xì)胞反應(yīng)。近年來最令人矚目的研究是揭示了CD

3、4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+regulatoryTcell，CD4+CD25+Tr)的存在。 在正常人和小鼠的外周血及脾臟組織的CD4+T細(xì)胞中約有5-10％的細(xì)胞持續(xù)高表達(dá)CD25分子(IL-2受體α鏈)，同時(shí)這一亞群細(xì)胞是CD45RB分子低表達(dá)。CD4+CD25+Tr具有免疫無能性和免疫抑制性兩大功能特征。其免疫無能性表現(xiàn)在對高濃度IL-2的單獨(dú)刺激、固相包被或可溶性抗CD3單抗以及抗CD3單抗、抗CD28

4、單抗的聯(lián)合作用呈無應(yīng)答狀態(tài)。CD4+CD25+Tr的免疫抑制性表現(xiàn)在經(jīng)TCR介導(dǎo)的信號刺激后能抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞的活化和增殖。 目前有關(guān)CD4+CD25+Tr細(xì)胞在臨床的應(yīng)用主要有兩方面。一方面通過增強(qiáng)調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活性，應(yīng)用于自身免疫性疾病和移植排斥的治療；另一方面，減少調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的活性，可應(yīng)用于腫瘤免疫治療和特異性疫苗接種。在Tr刪除的小鼠身上觀察到多種自身免疫性疾病的發(fā)生，提示Tr在T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫過程中扮演

5、著十分關(guān)鍵的角色。而設(shè)法去除注射了同種基因的腫瘤細(xì)胞的小鼠身上的Tr，產(chǎn)生了十分有效的抗腫瘤效應(yīng)。因此推斷Tr的增強(qiáng)將可下調(diào)腫瘤特異的免疫效應(yīng)。腫瘤環(huán)境中CD4+CD25+Tr比例增加，導(dǎo)致腫瘤免疫失調(diào)，去除這群細(xì)胞可有效誘導(dǎo)抗腫瘤免疫，這為腫瘤的治療提出了一種嶄新的思路。 本實(shí)驗(yàn)首先通過流式細(xì)胞術(shù)分析胃癌患者外周血中CD4+CD25+Tr的比例，并與健康對照組進(jìn)行比較，從而探討CD4+CD25+Tr與胃癌的分化程度及臨床分期的

6、關(guān)系；其次，用免疫磁性分離(magneticactivatedcellsorting，MACS)方法成功分選出胃癌患者外周血單個(gè)核淋巴細(xì)胞(PBMCs)中的CD4+CD25+Tr后，利用流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞增殖試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測CD4+CD25+Tr的增殖、抑制及擴(kuò)增能力。分別從細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外兩種水平的細(xì)胞因子角度檢測CD4+CD25+Tr的功能，探討胃癌的發(fā)生、發(fā)展的分子免疫學(xué)和細(xì)胞免疫學(xué)的基礎(chǔ)，為胃癌和其他消化道腫

7、瘤的診斷和治療尋找新的思路和方法，也可能為其他惡性腫瘤的免疫治療提供重要的參考資料和理論基礎(chǔ)。 第一部分胃癌患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的檢測及臨床意義 結(jié)論:1胃癌患者CD4+CD25+T細(xì)胞的比例顯著高于健康對照組；2Ⅲ、Ⅳ期患者CD4+CD25+T細(xì)胞的比例顯著高于Ⅰ、Ⅱ期胃癌患者；3不同分化程度的胃癌患者CD4+CD25+T細(xì)胞的比例高低無明顯差異。 第二部分人胃癌PBMCs中CD4+CD25

8、+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分選及鑒定 結(jié)論:1 MACS細(xì)胞分選系統(tǒng)能有效分選人PBMC中的CD4+CD25+T細(xì)胞和CD4+CD25-T細(xì)胞；2 MACS系統(tǒng)分選后CD4+CD25+T細(xì)胞較分選前的CD4+CD25+T細(xì)胞純度有明顯升高，且分選后的細(xì)胞活力均超過97％；3胃癌患者和健康對照組經(jīng)MACS分選后CD4+CD25+T細(xì)胞的純度及細(xì)胞活力間無顯著差異。 第三部分人胃癌CD4+CD25+Tr細(xì)胞的體外功能研究

9、結(jié)論:1.無論是健康對照還是胃癌患者，CD4+CD25+T細(xì)胞及CD4+CD25-T細(xì)胞在體外足夠的刺激條件下均可增殖；前者的增殖速度顯著慢于后者(P＜0.05)；2.CD4+CD25+T細(xì)胞在體外可明顯抑制CD4+CD25-T細(xì)胞的增殖及產(chǎn)生IFN-γ的能力，隨著CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)目的逐漸增多，這種抑制能力逐漸增加(P＜0.01)；3.健康對照及胃癌患者CD4+CD25+T細(xì)胞分泌Th2樣細(xì)胞因子IL-10、TGF-β均顯著高