nesprin-1α基因突變與特發(fā)性擴(kuò)張型心肌病相關(guān)性研究.pdf

1、目的：特發(fā)性擴(kuò)張型心肌病(Idiopathic Dilated Cardiomyopathy，IDCM)是引起心衰和導(dǎo)致心臟移植的常見原因，目前的研究表明，遺傳因素在IDCM發(fā)病中起著重要作用。核膜蛋白nesprin家族中的亞型nesprin-1α定位于細(xì)胞核內(nèi)膜，對(duì)維持細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)與功能發(fā)揮重要作用。nesprin-1α基因突變可能導(dǎo)致其與核纖層蛋白A/C、伊默菌素等結(jié)合性質(zhì)的改變，影響細(xì)胞核與細(xì)胞骨架之間的連接以及下游的信號(hào)傳遞系統(tǒng)

2、，有可能參與了IDCM的發(fā)生、發(fā)展。本課題對(duì)IDCM組及正常對(duì)照組樣本nesprin-1α基因19個(gè)外顯子DNA序列進(jìn)行突變篩查，獲得兩組樣本中各外顯子DNA突變數(shù)據(jù)，分析nesprin-1α基因突變與IDCM發(fā)病相關(guān)性，以期從分子基因水平為IDCM的早期診斷提供科學(xué)依據(jù)，幫助闡明IDCM的形成機(jī)制及其遺傳學(xué)基礎(chǔ)。 方法：應(yīng)用 primer 3軟件，設(shè)計(jì)擴(kuò)增 nesprin-1α基因外顯子序列的引物，為達(dá)到 DHPLC技術(shù)最高的

3、陽性檢出率，同時(shí)滿足SSCP技術(shù)所需的最佳條件，PCR 產(chǎn)物片斷大小控制在在150bp-350bp。各引物分別擴(kuò)增后，采用6％的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的特異性和濃度，分析片斷大小是否與設(shè)計(jì)大小相符，優(yōu)化PCR各項(xiàng)條件，確保PCR產(chǎn)物可用于后續(xù)的DHPLC及SSCP分析。通過構(gòu)建PCR產(chǎn)物DNA池與單個(gè)樣本間比較的方法，確定DHPLC檢測(cè)異源雙鏈的效能，建立篩查nesprin-1α基因突變的DHPLC方法；應(yīng)用不同的SSC

4、P實(shí)驗(yàn)參數(shù)對(duì)nesprin-1α基因各外顯子序列進(jìn)行SSCP突變篩查預(yù)試驗(yàn)，確定各序列最佳的SSCP突變篩查條件，建立篩查nesprin-1α基因突變的SSCP方法。用建立的方法，在218例IDCM組樣本及210例正常對(duì)照組樣本中，對(duì)nesprin-1α基因各外顯子序列進(jìn)行突變篩查，獲得相應(yīng)的基因突變數(shù)據(jù)并分析其與IDCM發(fā)病相關(guān)性。 結(jié)果：分別擴(kuò)增nesprin-1α 19個(gè)外顯子DNA序列后，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明，

5、PCR產(chǎn)物片斷大小與設(shè)計(jì)引物的理論大小相符合，濃度適當(dāng)且特異性好，可以滿足DHPLC及SSCP分析的要求。DHPLC技術(shù)與SSCP技術(shù)共檢出nesprin-1α基因突變位點(diǎn)12個(gè)，其中錯(cuò)義突變5處，分別為：Exon 9：1301 G→A，蛋白434：R→Q；Exon12：1696A→T，蛋白566：S→C；Exon 12：1773：C→A，蛋白591：N→K； Exon 19：2759 G→A，蛋白920 R→Q及Exon 19：276

6、4 G→A，蛋白922 G→S突變。同義突變7處，分別為：Exon 6：-12 G→A；Exon 8：-3 A→G； Exon 9：1311 G→A，蛋白437：P→P：Exon 9：1347 C→T，蛋白449： H→H：Exon 11：1593 C→T，蛋白：531 R→R；Exon 12：1683 G→C，蛋白561 L→L；Exon 12：1701 C→T，蛋白567：S→S。DHPLC檢出全部的突變，SSCP檢出10個(gè)突變位點(diǎn)

7、，未能檢出Exon 6：-12 G→A突變及Exon 12：1701 C→T突變。IDCM組中檢出全部的基因突變，且有3個(gè)錯(cuò)義突變?yōu)镮DCM組特有：蛋白434：R→Q突變位于SR4與LEM-like區(qū)之間，蛋白566：S→C突變與蛋白591：N→K突變位于LEM-like與SR5區(qū)之間，對(duì)照組樣本中未發(fā)現(xiàn)這 3 個(gè)錯(cuò)義突變，表明這些突變與 IDCM發(fā)病是相關(guān)的。除1311 G→A與1593 C→T外的5個(gè)同義突變?yōu)?IDCM組特有，這些

8、同義突變雖然對(duì)nesprin-1α蛋白序列沒有影響，但是它們可能通過DNA-蛋白質(zhì)相互作用、影響nesprin-lα表達(dá)水平、或者是影響其他相關(guān)蛋白的表達(dá)等途徑對(duì)IDCM的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生影響。 結(jié)論：本研究采用DHPLC技術(shù)及SSCP技術(shù)，對(duì)218例IDCM組樣本和210例對(duì)照組樣本進(jìn)行了nesprin-1α外顯子DNA序列突變篩查。在發(fā)現(xiàn)的12個(gè)突變位點(diǎn)中，3個(gè)錯(cuò)義突變以及5個(gè)同義突變只在IDCM組中檢出，表明nesprin．