體外合成GPC3和GPC3-SiRNA真核質(zhì)粒載體及轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞的研究.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、[目的]
   通過(guò)體外構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒載體pcDNA3.1+GPC3和GPC3-siRNA-1633,應(yīng)用酶切測(cè)序法進(jìn)行鑒定;通過(guò)脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入Huh-7細(xì)胞中,運(yùn)用MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的活性,熒光定量PCR和Western Blot分別檢測(cè)Huh-7細(xì)胞GPC3mRNA和蛋白的表達(dá);旨在探討體外合成GPC3和GPC3-siRNA真核質(zhì)粒載體并轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞的可行性。
   [方法]
   1、應(yīng)用s

2、iRNA設(shè)計(jì)軟件篩選能與GPC3mRNA配對(duì)的siRNA,并選擇對(duì)GPC3mRNA抑制率最高的siRNA;
   2、在Gene Bank中查找GPC3的基因序列,運(yùn)用Trizol法提取腎組織總RNA,并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,PCR擴(kuò)增GPC3基因編碼區(qū);
   3、利用限制性內(nèi)切酶BamH1和Bbs1將GPC3基因編碼區(qū)插入到質(zhì)粒載體pcDNA3.1+中;
   4、運(yùn)用Blast和NCBI/BLAST/Formatti

3、ng Results-JU73V5UH01N比對(duì)插入到質(zhì)粒載體pcDNA3.1中的GPC3序列。
   5、采用脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)將真核質(zhì)粒載體pcDNA3.1+GPC3和GPC3-siRNA-1633分別轉(zhuǎn)染至Huh-7細(xì)胞。
   6、運(yùn)用MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Huh-7細(xì)胞的細(xì)胞活性。
   7、通過(guò)熒光定量PCR和Western Blot檢測(cè)GPC3mRNA和蛋白的表達(dá)變化。
   [結(jié)果]

4、   1、可篩選出符合配對(duì)的siRNA為GPC3-siRNA-1564、GPC3-siRNA-1718、GPC3-siRNA-2134、GPC3-siRNA-1633、GPC3-siRNA-647、GPC3-siRNA-714,共6對(duì);其中GPC3-siRNA-1633的抑制率最高。
   2、在Gene Bank中查找GPC3的基因序列,經(jīng)提取腎組織RNA,并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增GPC3基因編碼區(qū)的序列F為5'GATTCAG

5、CCTTGGACATCAATG3',與原始序列完全一致。
   3、Blast和NCBI/BLAST/Formatting Results-JU73V5UH01N比對(duì)插入到質(zhì)粒載體pcDNA3.1中GPC3序列未出現(xiàn)變異。
   4、GPC3-siRNA-1633和GPC3真核表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞后細(xì)胞活性沒(méi)有改變,存活率高。
   5、GPC3-siRNA-1633真核質(zhì)粒載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞后

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