大腸桿菌熱敏性腸毒素雙突變體構(gòu)建及佐劑功能研究.pdf

1、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌產(chǎn)生的熱敏性腸毒素(Heat-labile enterotoxin,LT)具有粘膜免疫原性和免疫佐劑功能,但具有很強的毒性,只有降低或去除LT蛋白的毒性,才能有效地利用其佐劑功能。為了得到安全性好的LT蛋白,選擇其毒性關(guān)鍵位點63、72和192進(jìn)行雙突變研究,以期獲得無毒但具有免疫佐劑功能的熱敏性腸毒素。 以pET30a-LTK63、pET30a-LTR72質(zhì)粒為模板,利用重疊延伸PCR擴(kuò)增技術(shù)體外獲得LT雙突變

2、體LTK63/G192、LTR72/G192基因,雙酶切處理雙突變體和pET30a載體,構(gòu)建了pET30a-LTK63/G192、pET30a-LTR72/G192表達(dá)載體,PCR和酶切鑒定出陽性質(zhì)粒進(jìn)行測序,結(jié)果表明構(gòu)建的表達(dá)載體閱讀框架正確,突變體在192位點引入甘氨酸密碼子(AGA→GGA)。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)菌株,IPTG誘導(dǎo),誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物用SDS-PAGE檢測,各菌株均表達(dá)出約33kDa和13kDa的兩個蛋白帶,與

3、LTA、LTB亞基分子量相吻合。 Western-blot檢測,誘導(dǎo)表達(dá)的33KD、13KD蛋白均可與抗His抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。表達(dá)蛋白用Ni-NTA Resin進(jìn)行純化,胰酶處理后,以DEABAG為底物,檢測重組蛋白的ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性。結(jié)果,重組蛋白酶活性均顯著低于野生型蛋白,而與陰性對照PBS相近。Patent-mouse毒性試驗檢測顯示,LTK63/G192,LTR72/G192雙突變體蛋白毒性均有不同程度降低

4、,二者與LT相比差異均極顯著,與PBS差異顯著,且LTR72/G192的毒性略高于LTK63/G192。 LTK63/G192、LTR72/G192、LT蛋白分別與雞新城疫低毒力活疫苗(NDV)一起經(jīng)滴鼻免疫小鼠、雛雞。經(jīng)間接ELISA檢測小鼠血清IgG抗體、鼻液IgA抗體水平。結(jié)果,NDV與LT雙突變體蛋白免疫小鼠、雛雞的血清IgG、局部粘膜IgA抗體水平均高于單獨使用NDV免疫組,且LTR72/G192組抗體水平高于LTK6

5、3/G192組。經(jīng)MTT法分析雞脾臟T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng),結(jié)果發(fā)現(xiàn),LT及LT雙突變體蛋白免疫組的T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)均高于單獨使用NDV免疫組及PBS空白對照但,但LTR72/G192與NDV免疫組T淋巴細(xì)胞增殖能力最強。 研究獲得了減毒LT雙突變體LTR72/G192、LTK63/G192表達(dá)載體,并證實其表達(dá)產(chǎn)物ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性和Patent-mouse毒性均低于LT野生性蛋白,且均具有良好粘膜佐劑活性,為臨床開發(fā)其利用