葡萄球菌腸毒素超抗原抑制性肽與減毒突變體的構建和功能研究.pdf

1、超抗原是一種具有強大免疫刺激功能的新型蛋白質抗原，業(yè)已證明超抗原參與多種疾病的發(fā)病過程。金黃色葡萄球菌(金葡菌)腸毒素超抗原家族涉及的疾病譜非常廣泛，并且也是一種失能型的生物戰(zhàn)劑，一直是比較活躍的研究領域。已取得的研究進展提示我們，目前針對金葡菌腸毒素超抗原所致疾病除了臨床對癥支持治療外，尚無很好的針對超抗原的治療手段，因此，從其超抗原特性入手，尋找有效控制腸毒素毒性作用的方法，可以進一步為相關疾病的防治研究和生物武器防護提供新的手段。

2、 SEA、SEB、SEC和SED是常見的毒性作用較強的金葡菌腸毒素，國內外對其研究內容大多數是利用其超抗原免疫活性進行抗腫瘤臨床治療等，針對超抗原的活性本身來研究超抗原相關疾病的防治手段較少。目前的研究主要是針對腸毒素的免疫識別區(qū)域設計小分子多肽和構建并篩選腸毒素的減毒突變體，從這兩方面研究抑制腸毒素超抗原的活性的手段。但是大多數研究都是對單一種類的腸毒素研究，針對多種腸毒素的廣譜抑制性手段的研究很少。 基于上述問題，

3、我們針對葡萄球菌腸毒素同源序列設計了9條小分子多肽，通過細胞模型篩選具有廣譜抑制性的多肽分子，并運用動物模型檢測篩選到的抑制性多肽對動物的保護作用，研究抑制性肽與MHCII類分子的親和力，預測抑制性肽的空間結構，探討其廣譜抑制活性的機制；同時構建了SED減毒突變體，并檢測了該突變體的促人PBMC增殖活性、MHC II類分子結合活性和TCRvp特異性。主要研究內容和結果包括以下幾方面： 1.抑制性多肽的設計和合成，對金葡菌腸毒素家

4、族的序列進行比較，選擇具有同源性的保守序列設計多肽，共設計了9條多肽。 2.建立人外周血單個核細胞的細胞模型，檢測9條合成多肽對超抗原的抑制效應。主要從多肽對SEs刺激人PBMC的增殖和分泌IL-2、IFN-γ、TNF-β的抑制效應進行檢測，篩選具有廣譜抑制性效應的多肽，試驗結果顯示多肽P72對SEA、SEB和SEC超抗原活性具有明顯抑制作用，其他8條多肽對SEs的抑制作用不明顯。確證試驗顯示P72對PHA、ConA的促PBMC

5、增殖活性無抑制作用。 3.建立8周齡雌性BALB/c小鼠感染性休克的動物模型，以脂多糖(LPS)和D-氨基半乳糖(D-GalN)致敏小鼠，再用不同劑量的SE進行攻擊，獲得了此條件下SEA、SEB和SEC的最低致死劑量。利用該動物模型檢測多肽P72對SEA、SEB和SEC攻擊小鼠的保護效果，結果顯示P72對SEA、SEB和SEC致休克效應具有顯著的保護作用。 4.競爭結合實驗檢測抑制性多肽P72與MHCII類分子的結合活性

6、，結果顯示多肽P72不能與SEA、SEB和SEC有效競爭結合Raji細胞上的MHC II類分子，提示P72可能不是通過與MHCII類分子結合產生的抑制活性。 5.對抑制性多肽P72的空間結構進行預測，將P72在SEA、SEB、SEC的同源序列的空間結構進行對比，結果顯示3種超抗原與P72同源的序列在空間結構上具有高度的相似性。 6.構建了SEDN23A/H26R突變體。并對突變體蛋白進行純化、定量和免疫印跡分析。檢測了S

7、EDN23A/H26R突變體促T淋巴細胞增殖的活性，結果顯示其促增殖活性比SED顯著降低；以競爭實驗檢測SEDN23A/H26R突變體與MHC II類分子的結合活性，并用流式細胞儀檢測突變體TCRvp特異性變化。結果：突變體SEDN23A/H26R與MHCII類分子的親合力未發(fā)生變化，但刺激人TCRVβ5+T細胞水平顯著降低。 綜上，本研究設計并篩選到了1條廣譜抑制性多肽P72，P72能夠在體外和體內顯著抑制SEA、SEB、SE