GABRP對水牛乳腺上皮細(xì)胞增殖以及泌乳相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf

1、γ-氨基丁酸是大腦中抑制性遞質(zhì)的一種重要成分，在神經(jīng)信號傳遞中起著重要作用。除腦組織外，γ-氨基丁酸及其受體還存在于多種外周組織中。γ-氨基丁酸的受體有A、B、C三種類型，其中A、C屬于門控Cl-通道，B型受體是代謝型受體，屬于G蛋白偶聯(lián)家族。π亞基(GABRP)是發(fā)現(xiàn)的一種新型的A型受體亞基。目前對GABRP在癌組織中研究較多，發(fā)現(xiàn)它能調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，但有關(guān)其在外周內(nèi)分泌組織中的作用研究較少。在乳腺組織中，GABRP主要與乳

2、腺癌細(xì)胞的遷移有關(guān)，幾乎沒有與乳腺上皮細(xì)胞增殖分化方面的研究。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，GABRP基因是Stat5a下游的一個靶基因，GABRP基因的表達(dá)在小鼠妊娠后期顯著升高，推測π亞基在乳腺發(fā)育以及泌乳方面發(fā)揮著重要的作用。本課題通過研究GABRP基因?qū)λＨ橄偕掀ぜ?xì)胞增殖以及泌乳相關(guān)基因表達(dá)的影響，在細(xì)胞水平上初步了解π亞基的功能，研究結(jié)果為進(jìn)一步了解水牛乳腺細(xì)胞的生長規(guī)律及泌乳機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　1.水牛GABRP基因的克隆及其

3、在乳腺組織中的表達(dá)分析。以GenBank數(shù)據(jù)庫中牛的GABRP(NM_001015618.1)為參考序列設(shè)計(jì)合成特異性擴(kuò)增引物，以水牛乳腺組織總RNA為模板，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增水牛GABRP基因的cDNA序列，結(jié)果顯示，獲得的片段與河流型水牛GABRP基因序列的同源性為99.4％，說明克隆得到了水牛的GABRP基因;應(yīng)用QRT-PCR技術(shù)檢測不同時期水牛乳腺組織GABRP基因的表達(dá)，結(jié)果顯示，GABRP基因在泌乳期和非泌乳期乳腺組

4、織中都有表達(dá)，且非泌乳期的表達(dá)量要顯著高于泌乳期(P＜0.05);應(yīng)用免疫組化技術(shù)對GABRP蛋白在泌乳期水牛乳腺組織進(jìn)行定位分析，結(jié)果顯示，GABRP蛋白主要在乳腺組織的腺泡上皮中表達(dá)。
　　2.水牛乳腺上皮細(xì)胞的分離純化鑒定。從屠宰場取回新鮮的泌乳期水牛乳腺組織，利用組織塊貼壁法和胰蛋白酶消化差異法分離純化水牛乳腺上皮細(xì)胞，并用免疫熒光染色技術(shù)鑒定乳腺上皮細(xì)胞特異性骨架蛋白—角蛋白18。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，組織塊貼壁法可分離得到乳腺上皮

5、細(xì)胞，純化的乳腺上皮細(xì)胞表達(dá)角蛋白18，并且具有正常的增殖能力。
　　3.不同濃度GABA、GABAA受體激動劑muscimol處理對水牛乳腺上皮增殖和泌乳相關(guān)基因表達(dá)的影響。在水牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入50μm/L、100μm/L、500μm/L的GABA，0.5μm/L、5μm/L、50μm/L的muscimol，CCK8試劑盒檢測乳腺上皮細(xì)胞的增殖情況;流式細(xì)胞儀檢測不同濃度GABA和muscimol處理對水牛乳腺上皮

6、細(xì)胞周期的影響對水牛乳腺上皮細(xì)胞周期的影響;QRT-PCR技術(shù)檢測添加GABA和muscimol對細(xì)胞周期蛋白CyclinD1、GABRP以及mTOR、FABP3、GLUT等泌乳相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GABA、muscimol能顯著抑制水牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖(P＜0.05)，且抑制效率與GABA、muscimol的濃度及處理時間有關(guān)。不同濃度的GABA和muscimol處理均能增加G1期細(xì)胞比例，降低S、G2期細(xì)胞的比例;不同濃