構(gòu)建pTWIN1-EgAgB8-3原核表達系統(tǒng)和抗rEgAgB8-3多抗制備及其診斷價值評估.pdf

1、目的：克隆細粒棘球絳蟲AgB8/3(EgAgB8/3)抗原基因編碼片段，構(gòu)建有自切功能的原核表達載體pTWIN1-EgAgB8/3，并進行表達條件的優(yōu)化和初步純化，獲得較純的EgAgB8/3重組抗原(rEgAgB8/3)，制備抗rEgAgB8/3抗原的多克隆抗體，通過ELISA-雙抗夾心法檢測棘球絳蟲感染犬糞 EgAgB8/3天然抗原并對其診斷價值進行評估。
　　方法：根據(jù)Genebank登陸號(AF362442)下載目的基因核酸

2、序列，利用DNAman軟件設(shè)計引物，以實驗室?guī)齑娴膒ET32a-EgAgB8/3重組載體為模板，對 EgAgB8/3編碼分泌型多肽片段的核酸序列進行 PCR擴增，構(gòu)建 pEASY-T1-EgAgB8/3重組質(zhì)粒，經(jīng) PCR、酶切及測序鑒定后，將 EgAgB8/3抗原基因片段定向連入原核表達質(zhì)粒pTWIN1(+)上，將重組子pTWIN1-EgAgB8/3轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α，根據(jù)選擇標記的氨芐青霉素抗性基因篩選到陽性克隆后將 pT

3、WIN1-EgAgB8/3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大腸桿菌E.coli ER2566，IPTG誘導(dǎo)表達CBD-intein1-EgAgB8/3融合蛋白，通過幾丁質(zhì)柱結(jié)合 CBD結(jié)合域利用融合蛋白自我剪切特點裂解純化得到目的蛋白(rEgAgB8/3)，用SDS-PAGE電泳和western blot分析鑒定融合蛋白與目的蛋白rEgAgB8/3的表達量和純度。目的蛋白 rEgAgB8/3免疫動物后收集血清，采用硫酸銨沉淀法純化免疫血清總 IgG，部分

4、總 IgG用過碘酸鈉法進行標記，以未標記的總IgG包被抗體，標記的IgG為最終底物，通過ELISA-雙抗夾心法檢測棘球絳蟲感染犬糞抗原。
　　結(jié)果：成功克隆獲得EgAgB8/3基因目的片段并構(gòu)建具有蛋白自剪切功能的重組表達載體pTWIN1-EgAgB8/3，并鑒定其表達的融合蛋白主要以可溶形式存在；構(gòu)建的重組載體中融合標簽的幾丁質(zhì)結(jié)合域(CBD)和內(nèi)含肽(intein1)分別使親和層析純化和融合標簽自剪切一步完成得到高純度的目的蛋

5、白，免疫動物后獲得高效價多克隆抗體，用ELISA-雙抗夾心法對棘球絳蟲感染犬糞特異性抗原檢測的靈敏度和特異度分別為93.1％和97.6%。
　　結(jié)論：成功的構(gòu)建重組表達載體pTWIN1-EgAgB8/3，獲得高表達融合蛋白 CBD-intein1-EgAgB8/3，并經(jīng)簡單后續(xù)處理即可獲得含極少任何額外氨基酸的可溶性目的蛋白rEgAgB8/3，盡可能保證了其原有的結(jié)構(gòu)和活性，且免疫動物后制備的多克隆抗體用于ELISA-雙抗夾心法檢