雙重靶向性抗乳腺癌融合蛋白Δ1-9-G129R-T3原核表達質粒的構建及蛋白的誘導表達.pdf

1、目的：
　　利用基因重組技術,將具有特異性抑制乳腺癌細胞增殖作用的人催乳素受體(human prolactin receptor,hPRLR)拮抗劑Δ1-9-G129R-hPRL與具有特異性抗腫瘤血管生成活性的腫瘤抑素(tumstatin)的活性部位T3肽(69-88aa)進行橋連,構建新型雙重靶向性抗乳腺癌融合蛋白Δ1-9-G129R-T3的原核表達質粒,并在原核表達宿主中進行目的蛋白的誘導表達和鑒定,為進一步進行融合蛋白的功能

2、檢測奠定基礎。
　　方法：
　　首先以質粒pET22b(+)G129R-G129R為模板,PCR擴增兩端帶有限制性內切酶NdeI和XhoI以及NdeI和BamHI識別序列的目的基因Δ1-9-G129R-hPRL,并利用瓊脂糖凝膠電泳進行片段回收。再根據T3的cDNA序列,設計合成三段首尾互補的引物,采用重疊延伸PCR技術,擴增得到帶有限制性內切酶NdeI和XhoI以及BamHI和XhoI識別序列的目的DNA片段T3,并利用聚

3、丙烯酰胺凝膠電泳進行回收。然后,根據Δ1-9-G129R-hPRL的3’端與T3的5’端BamHI識別序列可互補的特點,將回收得到的Δ1-9-G129R-hPRL和T3混合作為模板,利用Δ1-9-G129R-hPRL的上游引物和T3的下游引物,PCR擴增得到帶有限制性內切酶 NdeI和XhoI酶切位點的融合基因片段Δ1-9-G129R-T3。將純化回收的Δ1-9-G129R-T3、Δ1-9-G129R-hPRL及T3片段通過T-A克隆分

4、別與pMD18-T載體進行連接,轉化大腸桿菌DH5α后,經藍白斑篩選,挑取陽性克隆進行擴增,提取質粒,NdeI和XhoI雙酶切鑒定后再次回收目的DNA片段。然后分別將雙酶切回收的目的基因片段插入pET22b(+)的NdeI和XhoI多克隆位點,構建原核表達載體pET22b-Δ1-9-G129R-T3、pET22b-Δ1-9-G129R和pET22b-T3。經DNA序列測定正確后,將這三種重組表達質粒轉化原核表達菌BL21(DE3),IP

5、TG誘導表達后收集菌體,超聲破碎,高速離心后分離沉淀和上清。最后通過SDS-PAGE和Western blot檢測和鑒定融合蛋白表達。
　　結果：
　　瓊脂糖凝膠電泳結果顯示我們利用PCR擴增的方法獲得了目的基因片段Δ1-9-G129R-T3(650 bp)、Δ1-9-G129R(586bp)和T3(72bp)。將NdeI和XhoI雙酶切回收的目的基因分別插入經同樣雙酶切的pET22b(+),構建3種重組表達質粒pET22b

6、-Δ1-9-G129R-T3、pET22b-Δ1-9-G129R和pET22b-T3。NdeI和XhoI雙酶切鑒定顯示酶切片段與插入的基因片段大小相符。DNA測序結果顯示,除2個同義突變外的DNA序列與GenBank中記載的cDNA序列完全一致。將這些質粒轉化 BL21(DE3)后,利用IPTG誘導目的蛋白表達,SDS-PAGE結果證實,在超聲處理后的沉淀中出現新蛋白條帶,且與預期的分子量(約24.7 kD、22.2 kD、2.4 kD