西氏貝蛔蟲(chóng)GAPDH基因和Tpx基因的原核表達(dá)與重組抗原診斷價(jià)值的評(píng)估.pdf

1、缸、，牛681lllllllllHL$111HIFllllllIJlllY3292796分熒芎翹玉5上⑧力10I裝掌大學(xué)SICHU^NAGRCUL九JR^LUNIVERSITY學(xué)號(hào)S2Ql盟512碩士學(xué)位論文西氏貝蛔蟲(chóng)GAPDH基因和Tpx基因的原核表達(dá)與重組抗原診斷價(jià)值的評(píng)估李宇指導(dǎo)教師楊光友教授學(xué)科專(zhuān)業(yè)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究方向動(dòng)物寄生蟲(chóng)與寄生蟲(chóng)病學(xué)2017年6月中文摘要大熊貓作為我國(guó)特有瀕危珍稀動(dòng)物有活化石和國(guó)寶之稱(chēng)，目前已被列入國(guó)家一級(jí)

2、重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物。大熊貓西氏貝蛔蟲(chóng)病是由西氏貝蛔蟲(chóng)寄生于大熊貓小腸等器官所引起的一種寄生蟲(chóng)疾病。西氏貝蛔蟲(chóng)是圈養(yǎng)大熊貓?bào)w內(nèi)的一種常見(jiàn)寄生蟲(chóng)，可引起宿主出現(xiàn)停食、嘔吐、腹瀉、消瘦、咳嗽、貧血、精神萎靡遲鈍等癥狀，蟲(chóng)體還可造成大熊貓胃腸道、膽管及胰管堵塞等，嚴(yán)重時(shí)甚至引起死亡。目前對(duì)該病的診斷主要依靠飽和硫酸鎂漂浮法及PCR檢測(cè)法，但這兩種方法均不能對(duì)該疾病進(jìn)行早期診斷。本研究擴(kuò)增并原核表達(dá)了西氏貝蛔蟲(chóng)硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶和三磷酸甘油醛脫氫酶，

3、并對(duì)其蛋白在蟲(chóng)體上的分布進(jìn)行了定位。同時(shí)，利用間接ELISA方法評(píng)價(jià)了硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶和三磷酸甘油醛脫氫酶的診斷價(jià)值，為大熊貓西氏貝蛔蟲(chóng)病的早期診斷和綜合防控奠定了基礎(chǔ)。一、西氏貝蛔蟲(chóng)三磷酸甘油醛脫氫酶的特征分析與重組抗原診斷價(jià)值的評(píng)估3磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH或G3PDH)是寄生蟲(chóng)新陳代謝過(guò)程中的一個(gè)多功能酶，也是糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶。有研究表明，GAPDH可作為寄生蟲(chóng)病診斷的候選抗原。本研究從西氏貝蛔蟲(chóng)的總RNA中擴(kuò)增出GA

4、PDH蛋白基因，其全長(zhǎng)ORF框含有1083bp，共編碼360個(gè)氨基酸，蛋白分子質(zhì)量約40KDa，西氏貝蛔蟲(chóng)GAPDH與豬蛔蟲(chóng)GAPDH的序列相似性為98％，原核表達(dá)重組GAPDH蛋白的分子量約為57KDa。免疫印跡顯示：重組蛋白能被大熊貓西氏貝蛔蟲(chóng)病陽(yáng)性血清識(shí)別，且為單一條帶。熒光免疫組化顯示：BsGAPDH廣泛分布于整個(gè)蟲(chóng)體，包括腸道、卵巢、肌肉、蟲(chóng)卵、子宮和角皮，尤其是在腸道和蟲(chóng)卵中的GAPDH蛋白含量豐富。以該重組蛋白為抗原建立大

5、熊貓西氏貝蛔蟲(chóng)病間接ELISA診斷方法，結(jié)果顯示其敏感性為9583％，特異性為100％，提示該蛋白可以作為大熊貓蛔蟲(chóng)病診斷候選抗原。二、西氏貝蛔蟲(chóng)硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶的特征分析與重組抗原診斷價(jià)值的評(píng)估寄生蟲(chóng)作為一種需氧生物，面對(duì)的不僅是自身代謝所產(chǎn)生的內(nèi)源性活性氧分子(ROS)，還要抵抗來(lái)自于宿主免疫所產(chǎn)生的ROS，為了適應(yīng)這種雙重高氧化的脅迫壓力，寄生蟲(chóng)需要通過(guò)一系列抗氧化系統(tǒng)來(lái)抵御ROS的氧化損傷作用，硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶(TPx)