基因重組腺病毒KH901的抗腫瘤研究.pdf

1、背景與目的：KH901是一種腫瘤特異、有條件復(fù)制的腺病毒，其E1A基因受基因工程改造的端粒酶反轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的控制，可在端粒酶高活性的腫瘤細(xì)胞中復(fù)制并裂解腫瘤細(xì)胞，而在端粒酶活性低的正常細(xì)胞中不能復(fù)制。同時(shí)，在腺病毒基因組E3區(qū)安插有GM-CSF的cDNA而取代MHC抑制基因，在腫瘤部位表達(dá)具有刺激免疫反應(yīng)的GM-CSF。GM-CSF被認(rèn)為是激發(fā)特異、持久抗腫瘤免疫的最主要的細(xì)胞因子。這樣，KH901不僅能通過(guò)溶解細(xì)胞效應(yīng)直接殺死腫瘤細(xì)胞而

2、產(chǎn)生局部的抗腫瘤效應(yīng)，而且也激發(fā)系統(tǒng)性的抗腫瘤免疫對(duì)遠(yuǎn)端的腫瘤組織產(chǎn)生作用。我們將通過(guò)體內(nèi)、體體外等一系列實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證KH901的選擇性復(fù)制和溶瘤作用，并考察其體內(nèi)、體外表達(dá)GM-CSF的水平和生物分布狀況。 實(shí)驗(yàn)方法：體外實(shí)驗(yàn)：將KH901感染平板培養(yǎng)的人腫瘤和正常細(xì)胞，分別在感染24h和72h后測(cè)定KH901表達(dá)GM-CSF的水平和病毒載體感染量，并以MTT法測(cè)定KH901對(duì)平板培養(yǎng)的人腫瘤和正常細(xì)胞的選擇性殺傷作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

3、：裸鼠皮下接種Hep3B、 LNcap和SCC9細(xì)胞，構(gòu)建相應(yīng)移植瘤裸鼠模型。KH901瘤體內(nèi)注射給藥，以“相對(duì)腫瘤增值率”和“抑瘤率”來(lái)觀察抗腫瘤效果。C57小鼠皮下接種CMT-64細(xì)胞，構(gòu)建CMT-64移植瘤裸鼠模型，觀察KH901瘤體內(nèi)給藥后的抗腫瘤效果，并檢測(cè)腫瘤引流淋巴結(jié)CD11c陽(yáng)性細(xì)胞的百分率。A549移植瘤體內(nèi)注射KH901，于不同的時(shí)間點(diǎn)采血并摘取腫瘤，以ELISA法測(cè)定血清和腫瘤勻漿液中rhGM-CSF含量，以定量P

4、CR測(cè)定KH901在腫瘤及各臟器中的組織分布。 結(jié)果：體外實(shí)驗(yàn)顯示，KH901在腫瘤細(xì)胞中大量復(fù)制(2526.4±136.8～2796.6±104.6TCID<,50>/Cell)，表達(dá)大量的人GM-CSF[621.907±10.17～3924.497±17.79 IU/(10<'6>細(xì)胞/24h)]，并顯示出明顯的殺傷作用(IC<,50>為0.31±0.06～0.19±0.01MOI)，而在正常細(xì)胞中復(fù)制較差(56.8±9.2

5、～90.1±14.4TCID<,50>/Cell)，只有少量的GM-CSF產(chǎn)生[13.397±0.82 IU/(10<'5>細(xì)胞/24h)]，殺傷作用輕微(IC<,50>為92.33±9.12～121.20±19.94 MOI)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，KH901對(duì)Hep3B、LNcap和SCC9裸鼠移植瘤皆有顯著的抗瘤效果；對(duì)CMT-64移植瘤有一定的抗瘤作用，但未顯示誘生鼠CDllc+細(xì)胞的能力；在A549移植瘤的腫瘤和血清中能檢測(cè)到大量腺病