重組腺病毒Ad35-anti-PD-1表達的PD-1抗體增強CTL抗腫瘤功能的研究.pdf

1、細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)是一類自身主要組織相容性復合體(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)限制性的抗原特異性的T細胞。因其具有有效靶向殺傷腫瘤細胞的特點，在腫瘤的個體化治療中占有重要地位。免疫學家希望通過基礎研究的突破來提高CTL過繼細胞治療(adoptivecelltherapy，ACT)的臨床療效。幸運的是，隨著人們對腫瘤免疫抑制機制研究的不斷深入，尤

2、其是免疫檢查點(checkpoint)PD-1(programmedcelldeathprotein1)和CTLA4(cytotoxicTLymphocyteAntigen4)的發(fā)現(xiàn)，為提高CTL的療效提供了新思路。PD-1和CTLA4為T細胞活化的負調(diào)控蛋白，它們抑制了T細胞活性，降低了T細胞抗腫瘤功能。
　　本課題主要研究了PD-1信號阻斷對CTL抗腫瘤功能的影響。首先我們構(gòu)建了攜帶PD-1抗體基因的5/35型重組腺病毒載體A

3、d35-anti-PD-1。
　　然后我們將經(jīng)PCR鑒定正確的4個病毒克隆感染293細胞，在不同時間點收集細胞上清，通過ELISA實驗檢測發(fā)現(xiàn)3號Ad35-anti-PD-1病毒克隆在72小時PD-1抗體的表達量最高，約600ng/mL。同時Westernbotting證實了表達的PD-1抗體包含正確的重鏈(約50kD)和輕鏈（約25kD）。
　　我們選取3號Ad35-anti-PD-1病毒克隆大量表達PD-1抗體，在72h

4、收集細胞上清，用ProteinG親和層析方法純化PD-1抗體。考馬斯亮藍染色證實了純化出的PD-1抗體擁有較高純度。ELISA實驗表明從100mL細胞上清中純化出的抗體質(zhì)量約在45μg。經(jīng)濃縮后，濃度為40μg/mL。
　　最后，我們從人的外周血單個核細胞中分離和培養(yǎng)了DC和T細胞。用重組腺病毒Ad35-TP53感染DC，再用該DC去致敏初始T細胞，獲得了TP53特異性的CTL。在CTL殺傷腫瘤細胞的體外實驗中，我們設置了加PD-