PD-1及其配體在前房相關免疫偏離中的表達和功能.pdf

1、眼組織結構的完整性對于維持正常視功能具有重要意義，此種組織結構完整性的維持有賴于多種機制，其中最重要的機制之一是眼內赦免機制。有實驗表明，前房是重要的免疫赦免區(qū)，對維持眼內免疫微環(huán)境的穩(wěn)定性有重要作用。 雖然諸多研究證明眼-脾軸的完整性、眼部微環(huán)境(如TGF-β、Fas ligand)等對ACAID的誘導具有重要作用，但ACAID誘導外周免疫耐受的機制仍不完全清楚。目前認為對免疫反應具有抑制作用的調節(jié)性T細胞(regulator

2、y T cell,Treg)是維持機體外周耐受的重要組成部分，而負性調節(jié)分子是參與Treg抑制作用的主要因素之一。 綜上所述，ACAID是機體的重要免疫赦免機制之一，對于正常視功能的維持具有重要意義；而PD-1:PD-L作為一種免疫抑制通路參與外周耐受的形成與維持，因此我們推測它對ACAID的誘導可能具有重要作用。本課題正是基于上述研究的最新進展，在我們以往的研究基礎上設計出來的。本課題首先用卵白蛋白(ovalbumin，OVA

3、)誘導ACAID，建立ACAID的動物模型；其次利用熒光定量實時聚合酶鏈反應(fluorescent quantitative real-time polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR)、Western免疫印跡、免疫組織化學方法、流式細胞技術(flow cyctometricanalysis，F(xiàn)CM)等從mRNA和蛋白水平、細胞數(shù)量、表型等方面檢測ACAID小鼠脾臟和虹膜睫狀體上PD-l及其配體的表達；最后通

4、過增殖實驗、過繼轉移實驗、酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-1inked immunosorbent assays，ELISA)等方法探討了ACAID小鼠脾臟PD-l<'+>細胞的功能特征，旨在闡明PD-1及其配體與ACAID形成之間的關系。 本課題的研究主要分為以下三部分： 第一部分ACAID模型的誘導和鑒定 目的：通過前房注射OVA來誘導ACAID，為實驗研究提供可靠的動物模型。 方法：采用乙醚吸入法麻

5、醉小鼠，在手術顯微鏡下用玻璃微量注射針將2μlOVA(20mg／m1)溶液注入小鼠前房；前房注射后第7d于小鼠后足墊內皮下注射100μl OVA(2.5mg/ml)溶液與等體積弗氏完全佐劑的混懸液，總體積為0.2ml;7d后于小鼠右耳廓皮內注射20μl OVA(10mg／ml)溶液，左耳廓皮內注射等量無菌磷酸鹽緩沖液，24h后檢測DTH反應。 結論：通過檢測DTH反應表明，前房注射OVA抗原100μg可誘導出ACAID，這為以后

6、的實驗研究提供了穩(wěn)定可靠的動物模型。 第二部分PD-1及其配體在ACAID小鼠脾臟和虹膜睫狀體中的表達 目的：檢測ACAID小鼠脾臟和虹膜睫狀體中PD-1及其配體在mRNA和蛋白水平的表達。 方法：(1)用Primer express 2.0軟件設計引物和探針，應用FQ-PCR檢測各組小鼠脾臟和虹膜睫狀體中PD-1、PD-L1和PD-L2 mRNA的表達。 (2)應用化學發(fā)光Western免疫印跡法

7、檢測各組小鼠脾臟PD-1、PD-L1和PD-L2的蛋白表達。 (3)用ABC法進行免疫組織化學染色，觀察各組小鼠虹膜睫狀體中PD-1和PD-L1陽性細胞的形態(tài)、分布及數(shù)量變化。 (4)取各組小鼠脾臟制備單細胞懸液，F(xiàn)CM方法分析PD-1在CD3<'+>、CD3<'+>CD4<'+>和CD3<'+>CD4<'->T細胞上的表達。 結果 (1)FQ-PCR結果顯示，在各組小鼠脾臟中均發(fā)現(xiàn)PD-1、

8、PD-Ll和PD-L2mRNA的表達；在ACAID小鼠中，此三種分子的mRNA表達顯著增高。 在各組小鼠的虹膜睫狀體中僅有PD-1和PD-Ll mRNA的表達，沒有檢測到PD-L2mRNA的表達；PD-1mRNA的表達在ACAID小鼠中顯著增加，而PD-L1mRNA的表達在陽性對照組中顯著增加。 (2)Western免疫印跡結果顯示，各實驗組中于相對分子質量為55kDa、43kDa和42kDa區(qū)可見PD-1、PD-L

9、l和PD-L2特異的陽性印跡帶，且三者蛋白的表達水平均在ACAID組中顯著增高。 (3)免疫組織化學染色結果顯示，PD-1和PD-L1陽性細胞多呈圓形或類橢圓形，主要分布于虹膜根部和瞳孔緣區(qū)，部分細胞沿虹膜血管排列，PD-1陽性細胞數(shù)在ACAID小鼠中增加，而PD-L1陽性細胞數(shù)在陽性對照組中增加。 (4)FCM結果顯示，在各組小鼠脾臟CD4<'+>、CD4<'->(CD8<'+>)T細胞中僅有少量的PD-1表達，P

10、D-1在CD4<'+>T細胞上的表達顯著高于其在CD8<'+>T細胞上的表達，CD4<'+>PD-1<'+>T細胞在ACAID小鼠中的表達顯著增高。 結論：在小鼠的虹膜睫狀體中，PD-1在ACAID小鼠中表達顯著增加，PD-Ll在陽性對照組中表達增高，PD-L2沒有表達。在小鼠的脾臟中，PD-1、PD-L1和PD-L2的mRNA和蛋白的表達在ACAID小鼠中均顯著增加，且PD-1高表達在CD4<'+>T細胞上，提示PD-1可能

11、參與了ACAID的誘導。 第三部分 ACAID小鼠脾臟CD4<,+>PD-1<'+>T細胞的功能特征 目的：探討小鼠脾臟CD4<'+>PD-1<'+>T細胞的功能特征，評價其在ACAID形成中的作用。 方法： (1)應用免疫磁珠細胞分選(magnetic affinity cell sorting，MACS)方法分選各組小鼠脾臟CD4<'->、CD4<'+>PD-1<'+>和CD4<'+>PD-1<'-

12、>T細胞，在lμg/ml anti-CD3 mAb的刺激下分別培養(yǎng)72h，<'3>[H]-標記甲基胸腺嘧啶(<'3>[H]-TdR)法分別檢測CD4<'+>PD-1<'+>和CD4<'+>PD-1T細胞的增殖情況。將分選后的CD4<'+>PD-1<'->T細胞與CD4<'+>PD-l<'+>T細胞按照不同比例進行混合培養(yǎng)，分別加入100μg／ml OVA及基礎培養(yǎng)液，<'3>[H]-TdR法測定CD4<'+>PD-1<'->T細胞的增殖

13、情況。 (2)MACS方法分選各組小鼠脾臟CD4<'->和CD4<'+>PD-1<'+>T細胞，在100μg／mlOVA的刺激下培養(yǎng)48h，ELISA方法檢測培養(yǎng)上清中IL-10水平。 (3)將分選后的CD4<'+>PD-1<'+>和CD4<'+>PD-1<'->T細胞分別注入正常BALB／e小鼠尾靜脈，3d后予常規(guī)皮下免疫，7d后檢測DTH反應。 (4)制備各組小鼠脾臟單細胞懸液，按照細胞表面和細胞內染色的方法

14、分別與anti-CD4、CD25、PD-1和Foxp3 mAb進行孵育，F(xiàn)CM分析CD4<'+>PD-1<'+>T細胞與CD4<'+>CD25<'+>Treg的關系。 結果：(1)在anti-CD3 mAb的刺激下，各組CD4<'+>PD-1<'+>T細胞的增殖水平均較低，而各組CD4<'+>PD-1<'->T細胞則具有較強的增殖能力，與CD4<'+>PD-1<'+>T細胞比較有顯著性差異。 將CD4<'+>PD-1<'

15、+>T細胞與CD4<'+>PD-1<'->T細胞按照不同比例進行混合培養(yǎng)，在OVA刺激下，ACAID小鼠CD4<'+>PD-1<'+>T細胞對CD4<'+>PD-1<'->T細胞的抑制能力顯著增強，且其抑制活性具有劑量依賴性。 (2)ELISA結果顯示，ACAID小鼠CD4<'+>PD-1<'+>T細胞分泌高水平的IL-10，與對照組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 (3)過繼轉移實驗結果顯示，將ACAID小鼠脾臟CD

16、4<'+>PD-1<'+>T細胞過繼轉移入正常BALB／c小鼠體內后，用OVA誘導的DTH反應受到抑制，而用牛血清白蛋白誘導的DTH反應沒有被抑制；將CD4<'+>PD-1<'->T細胞過繼轉移后不能抑制DTH反應，提示ACAID小鼠脾臟CD4<'+>PD-1<'+>T細胞能夠抑制抗原特異性的DTH反應。 (4)FCM結果顯示，約有23.8％的CD4<'+>PD-l<'+>T細胞表達CD25和Foxp3分子；約有13.3％的CD

17、4<'+>PD-1<'+>T細胞僅表達CD25分子；約有57.38％的CD4<'+>PD-1<'+>T細胞同時為CD25<'->Foxp3<'->細胞；各組間比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。 結論：ACAID小鼠脾臟中CD4<'+>PD-1<'+>T細胞能夠分泌大量的IL-10、抑制抗原特異性的細胞增殖和DTH反應；CD4<'+>PD-1<,+>T細胞與CD4<'+>CD25<'+>Treg部分重疊。提示CD4<'+>PD-1