FTY720在七氟醚誘導(dǎo)的大鼠進(jìn)行性神經(jīng)毒性中的保護(hù)效應(yīng).pdf

1、目的：FTY720所產(chǎn)生的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)是否能夠?qū)蛊叻岩l(fā)的神經(jīng)毒性。
　　方法：
　　1.動物實驗
　　所有的實驗程序都獲得山東省立醫(yī)院動物常務(wù)委員會批準(zhǔn)，120只7天齡SD大鼠從中國醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院獲得，動物可以自由飲水進(jìn)食，并提供12小時晝夜循環(huán)。
　　2.初級海馬神經(jīng)元的準(zhǔn)備
　　海馬神經(jīng)元是由18天大鼠制取，海馬組織從頭部解剖，神經(jīng)元通過胰蛋白酶和研磨來分離。神經(jīng)元被保存在37℃含5％C02和95

2、％空氣潮濕環(huán)境的無血漿B27母細(xì)胞介質(zhì)中。神經(jīng)元是經(jīng)體外實驗培養(yǎng)7天采用抗-MAP抗體提純。
　　3.麻醉暴露
　　神經(jīng)元在4×105/ml密度的六孔盤中培養(yǎng)。大鼠幼崽在一個37℃的密閉空間內(nèi)接觸七氟醚，七氟醚由一個固定口徑的噴霧器向空間內(nèi)傳送。接觸氣體包括七氟醚混合了3％的C02、21％的02和平衡N2。
　　活體實驗是采用出生后7天的大鼠幼崽。隨機分成5組（n=24每組）。對照組暴露在5％C0221％02和平衡N2

3、混合氣體中6小時，其他四組的所有大鼠注射溶劑(DMSO)、FTY720(1mg/Kg)，F(xiàn)TY720和MEK抑制劑(U012610mg/Kg)，或者FTY720和VPC20319(0.5 mg/Kg)。均暴露于2.1％的七氟醚5％C0221％02和平衡N2混合氣體中6小時。我們選擇2.1％的七氟醚濃度是與臨床相關(guān)的大鼠不能致死的濃度。氣體以2L/min速度吹入大鼠的環(huán)境中。七氟醚暴露后，每組中12只大鼠立即被實施安樂死，采集海馬組織做免

4、疫印跡分析。其他大鼠繼續(xù)生長至35天用作神經(jīng)認(rèn)知評估。
　　4.免疫印跡分析
　　正如前面描述的海馬組織和神經(jīng)元培養(yǎng)為免疫印跡做準(zhǔn)備。神經(jīng)元培養(yǎng)和海馬組織的溶解產(chǎn)物以12％的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺瓊脂電泳分離，然后進(jìn)行PVDF轉(zhuǎn)膜。初級抗體為抗ERK11/2抗體以及抗Bax抗體和抗Bcl-2抗體，隨后用辣根過氧化酶標(biāo)記的二級抗體孵育并顯色分析。
　　5.細(xì)胞凋亡分析
　　細(xì)胞凋亡的檢測采用FITC標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白

5、V(Annexin V)凋亡試劑盒進(jìn)行。細(xì)胞用冰的磷酸鹽緩沖劑洗脫，然后以1×106cell/ml的濃度以緩沖液混懸。細(xì)胞采用膜聯(lián)蛋白v-FITC和Propidium iodide在黑暗環(huán)境中染色15分鐘后以流式細(xì)胞儀分析。Annexin V-FITC陽性且Propidium iodide陰性的細(xì)胞被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞。
　　6.神經(jīng)損傷的評估
　　曠場試驗是用來評估一般運動活動、探索習(xí)慣和前面提到的焦慮。大鼠幼崽被暴露于七氟醚

6、中，然后置于曠場中，觀察大鼠在一定時間內(nèi)所通過區(qū)域數(shù)值。物體識別實驗是用兩組新事物識別任務(wù)來評估，大鼠幼崽在接觸七氟醚之前，先在盒子中用兩個識別物體來預(yù)檢測建立基線。七氟醚暴露后，將大鼠幼崽放在盒子里，允許它們探索兩個放置在一定距離的識別物體三分鐘。它們被移入盒子兩小時后將其中一個熟悉的物體換成不同形狀和外觀再重新測試。探索所有物體的時間被記錄。數(shù)據(jù)用大鼠幼崽探索新物體與熟悉物體時間百分比來表示。
　　結(jié)果：
　　1.七氟醚

7、是以一種時間依賴性方式誘發(fā)神經(jīng)元凋亡。
　　神經(jīng)元凋亡在七氟醚暴露3，6，9小時后采用流式細(xì)胞儀評估。與對照組相比神經(jīng)元凋亡隨時間增長。神經(jīng)元凋亡數(shù)分別是11.4±0.5％，24.9±1.9％，28.2±2.3％。相反，對照組暴露于混合氣體組9小時后凋亡率無明顯變化。
　　2.FTY720減輕體外實驗七氟醚誘發(fā)的神經(jīng)元凋亡。
　　為了闡述FTY720對于七氟醚誘發(fā)神經(jīng)元凋亡的保護(hù)效應(yīng)，細(xì)胞在暴露七氟醚時用不同濃度的FT

8、Y720培養(yǎng)。之前的研究表明超生理微摩爾濃度的FTY720致大鼠小腦神經(jīng)元凋亡。此外，一項早期臨床前期動物模型研究報道0.14μM濃度的FTY720才具有治療作用。因此，在我們的實驗中，我們檢測5-10nM的FTY720對神經(jīng)元的凋亡效應(yīng)。結(jié)果表明，10nM濃度的FTY720能有效保護(hù)神經(jīng)元對抗七氟醚的促凋亡作用。（17.2±1.3％，P＜O.05，七氟醚暴露6小時）。應(yīng)用FTY72050和100nM濃度，凋亡細(xì)胞降低到8.9±1.1％

9、和6.1±0.7％。
　　3.FTY720激活的S1P受體能夠預(yù)防體外實驗七氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡
　　當(dāng)FTY720被2型SPHK轉(zhuǎn)化成磷酸鹽時，在毫微摩爾濃度下，便具備了S1P1、S1P3、S1P4、S1P5的全激動劑功能。為了驗證這一假設(shè)FTY720主要擔(dān)當(dāng)神經(jīng)元中S1P1激動劑的這一假設(shè)，我們檢測了選擇性S1P1激動劑SEW2871和S1P1拮抗劑VPC23019對于七氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用，0.5μM的SEW2

10、871與50nM的FTY720具有相似的神經(jīng)保護(hù)作用。反之，0.5μM的VPC23019能夠消除FTY720的神經(jīng)保護(hù)作用?？傊@些結(jié)果表明FTY720對于S1P1的激活能夠阻礙七氟醚誘發(fā)的神經(jīng)凋亡。
　　4.FTY720通過使ERK l/2磷酸化來防止神經(jīng)元凋亡
　　新的證據(jù)表明通過S1P1受體的存活信號與ERK l/2相關(guān)。因此，我們測試FTY720是否能夠通過激活ERK l/2發(fā)揮抗凋亡作用。當(dāng)培養(yǎng)的神經(jīng)元暴露于七氟

11、醚中時，暴露組與對照組相比磷酸化的ERK1/2顯著降低，然而，F(xiàn)TY720組的磷酸化ERKl/2(p-ERKl/2)水平能夠顯著維持。此外，VPC23019處理能夠消除暴露于七氟醚下的FTY720對于p-ERKl/2水平的維持作用，表明FTY720通過結(jié)合S1P1受體來激活ERKl/2信號傳導(dǎo)。為了進(jìn)一步明確ERK l/2在FTY720神經(jīng)保護(hù)中的作用，在神經(jīng)元暴露于七氟醚時用FTY720和MEK抑制劑(U0126，5μM)處理， FT

12、Y720的抗凋亡作用被U0126消除，這些數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)TY720通過S1P1依賴的ERK l/2路徑激活來保護(hù)神經(jīng)元對抗七氟醚誘導(dǎo)的凋亡。
　　5.FTY720通過調(diào)節(jié)Bcl2/Bax比例來減弱七氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性。
　　麻醉劑誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡對麻醉劑神經(jīng)毒性其重要作用。為了檢驗Bcl-2/Bax比例的調(diào)節(jié)是否是FTY720對抗七氟醚誘發(fā)神經(jīng)凋亡的基礎(chǔ)，我們檢測Bcl-2，Bax細(xì)胞凋亡蛋白的水平。我們的結(jié)果表明七氟醚暴露能

13、明顯降低Bcl-2/Bax比例，導(dǎo)致斷裂細(xì)胞凋亡蛋白酶-3水平升高。相反，F(xiàn)TY720升高和Bcl-2/Bax比例的降低，能夠使七氟醚處理過的神經(jīng)元中的斷裂細(xì)胞凋亡蛋白酶-3減少。此外，我們發(fā)現(xiàn)，加入VPC23019或U0125能夠逆轉(zhuǎn)FTY720對于暴露七氟醚的神經(jīng)元的調(diào)節(jié)效應(yīng)?？偠灾現(xiàn)TY720通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax比例來防止七氟醚誘發(fā)的神經(jīng)凋亡。Bcl-2/Bax比例調(diào)節(jié)是通過S1P1依賴的ERKl/2激活來完成。

14、　　6.FTY720能夠減輕七氟醚暴露引起的神經(jīng)損傷
　　FTY720的神經(jīng)保護(hù)作用采用大鼠幼崽做測試，有報道稱給予大鼠0.1～1Mmg/kg的FTY720時，血漿濃度低于lng/ml，給予lmg/kg是安全的。因此，大鼠幼崽在暴露七氟醚之前注射媒介物(DMSO)或lmg/kgFTY720，F(xiàn)TY720和MEK抑制劑(U0126，lmg/kg)或FTY720和VPC23019（0.5mg/kg）。盡管七氟醚加媒介組大鼠活動距離輕微

15、降低，但與其他組比無顯著差異，表明大鼠沒有情緒抑制及運動功能障礙，反之，應(yīng)用兩個物體間的識別任務(wù)實驗來測試學(xué)習(xí)和識別記憶。七氟醚加媒介組的大鼠幼崽在探索新物體時花費了更多的時間，然而七氟醚加FTY720組與對照組花費時間相似，表明FTY720可以降低七氟醚誘發(fā)的神經(jīng)認(rèn)知損傷。我們同時觀察到共同應(yīng)用U0126和VPC23019能夠消除FTY720對于七氟醚誘發(fā)的神經(jīng)毒性的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　7.FTY720通過抑制七氟醚誘發(fā)的神經(jīng)元

16、凋亡來提高神經(jīng)產(chǎn)物。
　　為了進(jìn)一步明確FTY720通過防止神經(jīng)元凋亡來保護(hù)大鼠幼崽對抗七氟醚誘發(fā)的神經(jīng)毒性，我們采用免疫印跡分析法檢測凋亡分子與體外試驗相似，注射了FTY720的大鼠神經(jīng)元凋亡數(shù)少于只注射媒介組。由斷裂細(xì)胞凋亡蛋白酶-3水平的降低可以證明，此外，向大鼠體內(nèi)注射FTY720的同時注射U0126或VPC23019，斷裂細(xì)胞凋亡蛋白酶-3水平升高，出現(xiàn)了與活體實驗一致的神經(jīng)保護(hù)作用。在活體內(nèi)FTY720對于Bcl-2，

17、Bax和ERK l/2的調(diào)節(jié)效應(yīng)也被檢測到，表明了在活體內(nèi)FTY720通過S1P1依賴的ERK l/2信號傳導(dǎo)路激活來調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax比例。
　　結(jié)論：
　　通過我們的研究，可以與既往的研究相互印證，證實七氟醚可以誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，并可以導(dǎo)致大鼠神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，導(dǎo)致認(rèn)知與學(xué)習(xí)能力的降低，但是對于深層次的情緒方面如焦慮并沒有明顯影響。FTY720對七氟醚導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡以及大鼠神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)的損傷具有保護(hù)作用，可以消除七氟醚