三碘甲狀腺原氨酸減輕七氟醚神經(jīng)毒性的機(jī)制研究.pdf

1、七氟醚是臨床麻醉中常用的一種吸入性麻醉藥，因起效迅速，可控性好，氣道刺激性小等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于小兒麻醉。最近的研究表明常用的吸入全麻藥暴露對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)均有不同程度的毒害作用，主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能的下降。處于發(fā)育期和退行性改變期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)全麻藥的毒性尤為敏感。處于發(fā)育期的兒童暴露于吸入麻醉藥后，在其成長過程中會(huì)出現(xiàn)行為改變及精神癥狀，一項(xiàng)臨床回顧性研究表明小于四歲的小兒暴露于麻醉和手術(shù)會(huì)增加他們發(fā)育中的閱讀、寫作和數(shù)學(xué)計(jì)算

2、能力障礙的風(fēng)險(xiǎn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也表明長時(shí)間高濃度吸入七氟醚損害發(fā)育中的腦細(xì)胞，還可能導(dǎo)致遠(yuǎn)期的神經(jīng)認(rèn)知功能障礙。在老年患者，術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD)的發(fā)生率顯著高于實(shí)施同類手術(shù)麻醉的青壯年患者，且研究表明，吸入麻醉藥暴露可加重中樞神經(jīng)退行性改變，致原有認(rèn)知功能障礙加重。
　　最近的統(tǒng)計(jì)表明，美國每年約有數(shù)以百萬計(jì)的患兒需要手術(shù)和麻醉，如何防治吸入性全麻藥物如

3、七氟醚對(duì)于發(fā)育期大腦的神經(jīng)毒性作用，已經(jīng)成為近年來眾多臨床醫(yī)生和科學(xué)工作者共同探討的話題之一。目前由于七氟醚等全麻藥物的作用機(jī)理及其對(duì)發(fā)育期大腦的神經(jīng)毒性未能完全闡明，大部分的研究都是集中在臨床前的動(dòng)物水平。加之臨床研究的可行性難度較大，所以對(duì)于全麻藥物中樞神經(jīng)毒性防治的研究還處于探索的初步階段。而且大多是來自體外的非生理性激素或藥物，防治效果也并不確切。甲狀腺激素(TH)是人和動(dòng)物正常生長發(fā)育必需的一類激素，在大腦的發(fā)育、分化、功能的

4、維持中起著重要作用，可激活mTOR等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響基因轉(zhuǎn)錄與蛋白質(zhì)翻譯，調(diào)控神經(jīng)元增殖、突觸的發(fā)育成熟，改善學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能。在新生時(shí)期，也是大腦發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期。麻醉劑及其代謝產(chǎn)物可能對(duì)甲狀腺的功能狀態(tài)產(chǎn)生影響，干擾甲狀腺激素的分泌。本實(shí)驗(yàn)擬觀察TH對(duì)七氟醚麻醉后新生大鼠成年后認(rèn)知功能的影響及大腦海馬的神經(jīng)元顯微結(jié)構(gòu)、突觸后密度蛋白-95(PSD-95)、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體亞基2A與2B(NR2A/NR2B)表

5、達(dá)的變化，從認(rèn)知功能障礙相關(guān)機(jī)制的角度探討七氟醚中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性的發(fā)生及防治機(jī)制，為全麻藥物神經(jīng)毒性的防治提供新的思路。
　　目的:
　　通過曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(OFT)、糖水偏好實(shí)驗(yàn)(SPT)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)(EPMT)、水迷宮實(shí)驗(yàn)(WMT)等行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，觀察新生大鼠七氟醚麻醉及T3干預(yù)后成年期大鼠認(rèn)知功能和情緒的改變;通過原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)觀察大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡情況;通過Nissl染色方法觀察海馬CA1及CA3區(qū)神

6、經(jīng)元的密度;應(yīng)用溴脫氧嘧啶(BrdU)標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記大鼠海馬齒狀回(DG)區(qū)新增殖細(xì)胞以觀察神經(jīng)元增殖情況;應(yīng)用高爾基銀染色技術(shù)觀察大鼠成年時(shí)期海馬區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)改變;Western Blot檢測(cè)大鼠海馬區(qū)NMDA受體亞基NR2A、NR2B及其錨定蛋白PSD-95的表達(dá);研究和探討圍麻醉期三碘甲狀腺原氨酸(T3)的使用能否減輕七氟醚對(duì)新生大鼠大腦的神經(jīng)毒性作用及其機(jī)制。
　　方法:
　　雌性SD大鼠處鼠5只，體重約180～2

7、20 g，成年雄性SD大鼠2只，雌鼠成功交配后自然分娩，待新生鼠出生后7 d(P7)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每只母鼠的子鼠隨機(jī)分為生理鹽水(NS)組，七氟醚(SEV)組和T3組，組內(nèi)雌雄各半。NS組腹腔注射5 ml/kg生理鹽水（與T3組等體積/體重比），SEV組于麻醉前0.5 h腹腔注射5 ml/kg生理鹽水，T3組麻醉前0.5 h腹腔注射T3100μg/kg，每組均連續(xù)注射3d，每次間隔24 h。首次給藥0.5 h后將SEV組和T3組新生鼠放入自

8、制的22 cm×13cm×12 cm透明有機(jī)玻璃箱內(nèi)，箱底鋪鈉石灰，箱內(nèi)持續(xù)給予1 L/min流量的七氟醚與空氣的混合氣體，出口處連接麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀確保箱內(nèi)七氟醚的濃度維持在2％左右，持續(xù)麻醉6h后結(jié)束。NS組同樣的裝置給予1 L/min流量的空氣6h。整個(gè)箱子放在恒溫板上，溫度37.0～38.0℃。且監(jiān)測(cè)新生鼠呼吸、皮膚及口唇黏膜顏色，整個(gè)過程無呼吸抑制等異常情況發(fā)生。待麻醉結(jié)束后6h各組隨機(jī)取3只新生鼠，斷頭取腦后制備石蠟切片，后行

9、TUNEL染色計(jì)算DG區(qū)和SVZ區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞密度。另麻醉結(jié)束后當(dāng)天每組隨機(jī)取5只新生鼠腹腔注射BrdU(50 mg/kg)，連續(xù)注射7d后斷頭取腦行免疫熒光染色計(jì)算DG區(qū)BrdU與DCX、GFAP雙標(biāo)個(gè)數(shù)與BrdU單標(biāo)的比例。余飼養(yǎng)至21d時(shí)斷奶，繼續(xù)飼養(yǎng)至25 d進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。將各組大鼠隨機(jī)分為兩批，第一批進(jìn)行WMT和EPMT。第二批進(jìn)行OFT和SPT。第一批大鼠，每組隨機(jī)取13只大鼠進(jìn)行連續(xù)3天WMT，休息1天后進(jìn)行EPM

10、T。第二批大鼠從P25開始進(jìn)行連續(xù)3天OFT，P28開始連續(xù)三天進(jìn)行SPT。行為學(xué)結(jié)束后，每組隨機(jī)取5只大鼠(1～2只/母鼠)過量麻醉處死，取大腦組織固定后制備冰凍切片行Nissl染色觀察海馬CA1及CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞密度;每組隨機(jī)取3只大鼠過量麻醉后，快速取大腦行高爾基銀染色，分別觀察海馬CA1、CA3區(qū)錐體細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)（樹突分支數(shù)目、樹突總長度以及空間分布）;在麻醉結(jié)束后6 h(P7)、P15、P30，各組隨機(jī)取5只（1只/母鼠）大鼠

11、的腦組織在冰面上快速分離，獲得海馬區(qū)組織行Western Blot檢測(cè)NR2A、NR2B，及其錨定蛋白PSD-95蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.所有七氟醚吸入麻醉的新生鼠麻醉及蘇醒過程平穩(wěn)，無呼吸抑制等異常情況出現(xiàn)，給藥后的9天內(nèi)，體重變化趨勢(shì)組間無顯著性差異(P＞0.05)。SEV組和T3組各有一只體重偏低的子鼠（分別為21 g，23 g）不再參與后繼的實(shí)驗(yàn)。
　　2.麻醉結(jié)束后6h，與NS組相比較，SEV組D

12、G區(qū)、SVZ區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞密度均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01及P＜0.05)，而T3組與NS組比較，DG區(qū)和SVZ區(qū)的TUNEL陽性細(xì)胞密度均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。P15時(shí)，SEV組子鼠DG區(qū)BrdU/DCX、BrdU/GFAP雙標(biāo)的陽性細(xì)胞數(shù)目與BrdU陽性細(xì)胞數(shù)目的比值均低于對(duì)照組(P＜0.05)，T3組BrdU/GFAP雙標(biāo)細(xì)胞個(gè)數(shù)與BrdU陽性細(xì)胞數(shù)目的比值高于SEV組(P＜0.05)，T3組與NS組比

13、較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。七氟醚可減少大腦中神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，而T3可以降低七氟醚對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響。
　　3.P25～P30，SEV組大鼠表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力的減退，以及一定程度的抑郁和焦慮樣情緒改變，與SEV組比較，T3組大鼠的焦慮和抑郁樣情緒以及學(xué)習(xí)能力均有明顯改善。具體表現(xiàn)為:和NS及T3組相比，SEV組大鼠水迷宮的逃避潛伏期顯著延長（P＜0.01及P＜0.05），NS組和T3組相比較逃避潛伏期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意

14、義(P＞0.05);在SPT中，SEV組糖水飲用率較NS組顯著降低(P＜0.01)，而T3組與NS組糖水飲用率相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。P25～P27時(shí)，OFT中，SEV組大鼠在中央格區(qū)的停留時(shí)間較其他兩組顯著延長(P＜0.05)，T3組在中央格區(qū)的停留時(shí)間與NS組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。P30時(shí)，EPMT中，三組大鼠在開放臂（open arms）停留的時(shí)間，組間比較均無顯著性差異(P＞0.05)。這些行為學(xué)結(jié)

15、果表明，新生鼠七氟醚麻醉可致其成年期的學(xué)習(xí)記憶功能損害，并在一定程度上有焦慮和抑郁樣復(fù)雜情緒表現(xiàn)，T3在圍麻醉期的應(yīng)用可以改善七氟醚對(duì)新生大鼠成年期學(xué)習(xí)記憶能力的損害和情緒的影響。
　　4.P30時(shí)，SEV組在CA3區(qū)細(xì)胞密度顯著低于NS組及T3組（P＜0.01），NS組及T3組相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);而CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞密度，三組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。P30時(shí)，SEV組和T3組海馬CA3區(qū)錐體

16、神經(jīng)元樹突總長度均顯著短于NS組(P＜0.001，P＜0.05)，且SEV組在CA3區(qū)的錐體神經(jīng)元樹突分支數(shù)目較對(duì)照組顯著減少(P＜0.01)，而T3組與NS組樹突分支數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);在CA1區(qū)，SEV組錐體神經(jīng)元的樹突總長度較NS組顯著減少(P＜0.05)，T3組與NS組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但CA1區(qū)錐體神經(jīng)元樹突分支數(shù)目，三組間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。該數(shù)據(jù)表明，七氟醚對(duì)新生

17、大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的發(fā)育有損害作用，可導(dǎo)致CA1和CA3區(qū)錐體神經(jīng)元不同程度的發(fā)育障礙，而T3在圍麻醉期的使用可以減輕其對(duì)海馬錐體神經(jīng)元的毒性作用。
　　結(jié)論:
　　幼鼠在新生時(shí)期，七氟醚麻醉可導(dǎo)致中樞神經(jīng)損傷，出現(xiàn)海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡增多，影響海馬DG區(qū)的細(xì)胞增殖，主要是新生的未成熟神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖;大鼠成年期海馬CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞減少，CA1及CA3區(qū)錐體神經(jīng)元發(fā)育障礙;成年后的神經(jīng)行為學(xué)出現(xiàn)異常，表現(xiàn)為焦慮和抑郁的