七氟醚和氫氣的神經(jīng)保護作用及相關(guān)機制研究.pdf

1、由于患者自身患有心腦血管疾病、手術(shù)因素和麻醉因素，造成圍手術(shù)期腦、脊髓缺血再灌注損傷的病例并不少見，而且一旦發(fā)生，后果極為嚴重。比如腦血管畸形手術(shù)腦缺血再灌注損傷的發(fā)生率高達42.9％，圍手術(shù)期腦中風一旦發(fā)生，死亡率高達33-60％。胸腹主動脈瘤手術(shù)因阻閉主動脈造成脊髓缺血再灌注損傷，術(shù)后截癱的發(fā)生率高達10％以上。因此如何有效的預(yù)防和治療圍手術(shù)期腦、脊髓缺血再灌注損傷是臨床亟待解決的一個關(guān)鍵問題。不同于普通的“腦中風”或因意外造成的脊

2、髓損傷，圍手術(shù)期的腦、脊髓缺血再灌注損傷具有一定的可預(yù)見性。因此，采取早期干預(yù)措施預(yù)防和治療圍術(shù)期腦、脊髓損傷，不僅可行而且意義重大。
　　吸入麻醉劑作為臨床應(yīng)用最為廣泛的麻醉劑其神經(jīng)保護作用已越來越受到研究者的關(guān)注。本實驗室前期研究證明缺血前給予吸入麻醉劑七氟醚預(yù)處理可以明顯減輕缺血-再灌注后脊髓神經(jīng)元損傷，改善動物神經(jīng)行為學，但是其神經(jīng)保護作用的具體機制并不清楚。雙孔鉀通道是近年發(fā)現(xiàn)的一類新的鉀通道亞型，其中TREK-1高表達

3、于哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)。新近的研究發(fā)現(xiàn)TREK-1通道的開放與神經(jīng)保護之間存在密切聯(lián)系。然而TERK-1分子是否參與吸入性麻醉劑預(yù)處理誘導的神經(jīng)保護作用有待明確。本研究第一部分旨在探討TREK-1在七氟醚預(yù)處理誘導的腦保護中扮演了什么角色，以其闡明七氟醚預(yù)處理的關(guān)鍵機制，為其臨床運用提供新的科學依據(jù)。
　　在致力于尋找合適的預(yù)處理藥物和方案進行預(yù)防的同時，我們同樣關(guān)注腦、脊髓損傷后的早期治療，因為早期治療較之康復治療對于改善患者

4、預(yù)后具有更重要的意義。早期氫氣治療近年來在多類器官損傷中表現(xiàn)出一定療效，包括急性的腎臟、心臟、肝臟的缺血再灌注損傷，肺臟的炎癥損傷，以及膿毒血癥的治療等方面。一些研究證實，富含氫的鹽水或水可減輕創(chuàng)傷性脊髓損傷。此外，我們先期的研究結(jié)果顯示，吸入氫氣可明顯提高膿毒癥小鼠的生存率，減少多器官損傷。這些結(jié)果都提示我們，早期氫氣治療很可能對于脊髓缺血再灌注損傷有效。本研究第二部分主要探討氫氣在缺血性脊髓損傷早期治療中的作用及其相關(guān)機制。

5、　　第一部分TREK-1在七氟醚預(yù)處理誘導的腦缺血耐受中的作用機制研究
　　實驗一七氟醚預(yù)處理對局灶性腦缺血-再灌注后TREK-1表達的影響
　　目的：探討七氟醚預(yù)處理誘導腦缺血耐受時TREK-1表達的改變。方法：采用大腦中動脈阻閉（MCAO）的方法，制作大鼠局灶性腦缺血-再灌注模型。雄性Sprague-Dawley大鼠24只，隨機分為3組（n=8）：①預(yù)處理缺血組，大鼠接受2.7％七氟醚與97％氧氣混合吸入預(yù)處理45min

6、，60min后行MCAO90min；②單純?nèi)毖獙φ战M，大鼠接受97％氧氣吸入45min，60min后行MCAO90min；③假手術(shù)組，大鼠接受2.7％七氟醚與97％氧氣混合吸入預(yù)處理45min，但不行MCAO模型。分別于再灌注24、48、72h行神經(jīng)功能評分（NBS），末次評分后取腦行TTC染色并分析腦梗死容積結(jié)果。同時，另一部分動物分為相同三組（n=12），分別于再灌注4、24、72h取材進行Western-blot及Real-tim

7、ePCR實驗，觀察腦部TREK-1在不同時間點表達變化情況。結(jié)果：（1）TTC結(jié)果分析：七氟醚預(yù)處理組再灌注72h后梗死容積小于單純?nèi)毖獙φ战M（P<0.05）。（2）神經(jīng)功能評分：假手術(shù)組動物無運動神經(jīng)功能改變，預(yù)處理缺血組動物評分均高于同一時間點單純?nèi)毖獙φ战M（P<0.05）。（3）蛋白含量：預(yù)處理缺血組動物TREK-1蛋白表達量高于同一時間點單純?nèi)毖獙φ战M（P<0.05）。（4）mRNA：預(yù)處理缺血組動物TREK-1mRNA轉(zhuǎn)錄水平

8、高于同一時間點單純?nèi)毖獙φ战M（P<0.05）。結(jié)論：七氟醚預(yù)處理后行局灶性腦缺血再灌損傷，腦組織中TREK-1較單純?nèi)毖M在轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平均明顯增高。
　　實驗二下調(diào)細胞TREK-1表達對七氟醚預(yù)處理誘導神經(jīng)保護作用的影響
　　目的：在七氟醚預(yù)處理的體外培養(yǎng)細胞氧糖剝奪模型抑制TREK-1蛋白表達，明確TREK-1蛋白表達在七氟醚預(yù)處理的神經(jīng)保護中的作用。方法：（1）人神經(jīng)母細胞瘤細胞株（SH-SY5Y）誘導分化鑒定：根

9、據(jù)不同時間誘導分化后細胞的神經(jīng)元特異性核蛋白NeuN和神經(jīng)元骨架蛋白βⅢ-Tublin表達結(jié)果，確定細胞誘導分化為類神經(jīng)元的最佳時間。（2）細胞siRNA干擾與鑒定：向類神經(jīng)元細胞加入TREK-1小RNA干擾成品后測定TREK-1表達。（3）siRNA干擾對預(yù)處理效應(yīng)的影響：①對照組：細胞未經(jīng)siRNA干擾、七氟醚預(yù)處理和氧糖剝奪；②預(yù)處理+小RNA干擾+氧糖剝奪組：細胞經(jīng)siRNA干擾，24h后2.4％七氟醚預(yù)處理2h，24h后進行氧

10、糖剝奪2h；③預(yù)處理+氧糖剝奪組：細胞未經(jīng)siRNA干擾，2.4％七氟醚預(yù)處理2h；④對照組+小RNA干擾+氧糖剝奪組：細胞經(jīng)siRNA干擾，24h后對照空氣處理2h，24h后進行氧糖剝奪2h；⑤對照組+氧糖剝奪組：細胞未經(jīng)siRNA干擾，對照空氣處理2h，24h后進行氧糖剝奪2h。所有細胞均于末次處理后24h行細胞爬片和蛋白提取。結(jié)果：（1）誘導分化鑒定：Western-blot和免疫熒光結(jié)果均顯示神經(jīng)元特異性核蛋白NeuN以及神經(jīng)元

11、骨架蛋白βⅢ-Tublin誘導分化7天組表達最強（P<0.05），因此確定誘導分化的時間為7天。（2）siRNA干擾與鑒定：Western-blot結(jié)果顯示小RNA抑制組TREK-1表達明顯減低，與溶劑對照組和亂序?qū)φ战M相比有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。(3)siRNA干擾對預(yù)處理效應(yīng)的影響：Western-Blot和免疫熒光結(jié)果均顯示：預(yù)處理+小RNA干擾+氧糖剝奪組凋亡蛋白Capase-3的表達量明顯升高，與對照組+氧糖剝奪組相比無

12、統(tǒng)計學差異，與預(yù)處理+氧糖剝奪組比較有統(tǒng)計學差異（P<0.05）；MTT結(jié)果顯示預(yù)處理+小RNA干擾+氧糖剝奪組細胞OD值較預(yù)處理+氧糖剝奪組明顯降低，細胞死亡增加，與對照組+氧糖剝奪組無統(tǒng)計學差異。結(jié)論：細胞水平證實抑制TREK-1蛋白表達逆轉(zhuǎn)了七氟醚預(yù)處理的神經(jīng)保護作用，說明TREK-1介導了七氟醚預(yù)處理誘導的神經(jīng)保護作用。
　　實驗三下調(diào)大鼠腦TREK-1表達對七氟醚預(yù)處理誘導腦缺血耐受的影響
　　目的：研究在體抑制T

13、REK-1蛋白表達后，七氟醚預(yù)處理誘導的腦缺血耐受有無改變。方法：（1）活體siRNA干擾與鑒定：大鼠進行單次siRNA側(cè)腦室注射，24h后取材，與對照組比較TREK-1表達情況；（2）siRNA干擾對缺血耐受性的影響：雄性SD大鼠90只，隨機分為5組（n=18）：①假手術(shù)組，大鼠僅行分離而不阻閉血管；②對照組，大鼠接受97％氧氣吸入45min；③預(yù)處理+MCAO組，大鼠接受2.7％七氟醚與97％氧氣混合吸入預(yù)處理45min；④小RNA

14、干擾+預(yù)處理+MCAO組，大鼠進行單次siRNA側(cè)腦室注射，24h后大鼠接受2.7％七氟醚與97％氧氣混合吸入預(yù)處理45min；⑤小RNA干擾亂序?qū)φ?預(yù)處理+MCAO組，大鼠進行單次siRNA亂序?qū)φ諅?cè)腦室注射，24h后大鼠接受2.7％七氟醚與97％氧氣混合吸入預(yù)處理45min。后四組均于處理后60min行MCAO90min。每組動物分別于缺血-再灌注24、48、72h進行雙盲神經(jīng)行為學評分，并在72h評分結(jié)束后取腦進行TTC染色，觀

15、察腦梗死容積情況。結(jié)果：（1）神經(jīng)功能評分（NBS）：再灌注24、48、72h小RNA干擾預(yù)處理+MCAO組動物NBS低于預(yù)處理+MCAO組（P<0.05），與對照組相同時間點相比無統(tǒng)計學差異。（2）TTC結(jié)果分析：再灌注72h小RNA干擾+預(yù)處理+MCAO組動物腦梗死容積大于預(yù)處理+MCAO組（P<0.05）。結(jié)論：下調(diào)大鼠腦組織TREK-1表達后，七氟醚預(yù)處理誘導的腦缺血耐受作用消失，表明TERK-1蛋白表達上調(diào)是七氟醚預(yù)處理誘導腦

16、缺血耐受的重要機制。
　　第二部分氫氣治療脊髓缺血再灌注損傷的作用及機制研究
　　實驗一圍術(shù)期早期氫氣治療在兔脊髓缺血再灌注損傷中的作用
　　目的：探討早期氫氣治療在脊髓缺血再灌注損傷中的保護作用。方法：濃度為1％，2％，4％的氫氣與麻醉氣體混合吸入，共同給予麻醉動物，治療時間為脊髓缺血再灌注前10min及再灌注60min，總計70min。用儀器實時監(jiān)控H2濃度，使其達到預(yù)期濃度。圍術(shù)期（包括缺血前10min到再灌注6

17、0min）監(jiān)測動脈血氣、血糖。再灌注24、48及72h對動物進行后肢運動功能評估。在最后一次運動功能評估后，取L3-4節(jié)段，進行組織HE染色，并進行病理學檢查，計數(shù)前角剩余正常運動神經(jīng)元數(shù)量，進行統(tǒng)計分析。結(jié)果：各組間生理學參數(shù)，包括動脈血壓、血氣和血糖無統(tǒng)計學差異。對照組完全癱瘓，2％和4％氫氣吸入組，運動神經(jīng)評分明顯高于對照組(P<0.05)，1％氫氣治療組與對照組相比較，沒有統(tǒng)計學差異，4％組與2％組間沒有統(tǒng)計學差異。在2％和4％

18、H2組，前角正常神經(jīng)元數(shù)目明顯多于對照組(P<0.05)，兩組之間無統(tǒng)計學差異；而1％H2組，前角剩余正常運動神經(jīng)元數(shù)目與對照組相比沒有統(tǒng)計學差異。結(jié)論：2％和4％氫氣吸入能明顯改善脊髓缺血再灌注損傷后動物運動神經(jīng)功能，過低濃度（1％）氫氣吸入則無改善，4％與2％濃度組相比，并沒有使運動神經(jīng)功能得到進一步改善。
　　實驗二氫氣吸入治療對兔脊髓缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的影響
　　目的：炎癥和氧化應(yīng)激是脊髓缺血再灌注損傷

19、的關(guān)鍵機制，本部分實驗主要研究氫氣吸入能否調(diào)節(jié)脊髓缺血后的炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)。方法：根據(jù)實驗一結(jié)果，本部分采用2％氫氣吸入作為治療方案，進一步進行機制研究。18只動物隨機分為3組（n=6）：假手術(shù)組（sham）、對照組、2％氫氣治療組。sham組不接受缺血，對照組和治療組接受缺血，方案同實驗一。再灌注6、8、12、24、48及72h，檢測血清及缺血脊髓節(jié)段8-iso-PGF2α、MDA、SOD、CAT、TNF-α及HMGB1水平，結(jié)果進

20、行統(tǒng)計分析，并在再灌注72h后，進行TUNEL染色及caspase-3激酶活性檢測。結(jié)果：（1）在各時間點，H2治療組血清及缺血脊髓節(jié)段MDA和8-iso-PGF2α含量均低于缺血對照組(P<0.05)；（2）對照組血清和脊髓內(nèi)SOD和CAT的活性低于Sham組(P<0.05)，H2治療組SOD和CAT活性明顯高于缺血對照組(P<0.05)；（3）對照組血清和脊髓內(nèi)TNF-α和HMGB1明顯高于假手術(shù)組（P<0.05），而H2治療組在各