rAAV-FGF21及rAAV-FGF21-GLP1對2型糖尿病的治療研究.pdf

1、第一章，質粒及病毒的鑒定
　　目的:檢測重組質粒構建的正確性以及其表達目的蛋白的情況，了解包裝的重組病毒的生物學活性。
　　方法:1.用限制性內切酶(XbaⅠ、BamHⅠ)對重組質粒(pAAV-FGF21、pAAV-FGF21-GLP1)進行酶切，凝膠電泳檢測其產物大小。2.用重組質粒(pAAV-FGF21、pAAV-FGF21-GLP1)轉染HEK293細胞，收集其細胞培養(yǎng)上清，用Western Blotting及ELIS

2、A檢測其中FGF-21及GLP-1蛋白的表達。3.用rAAV-mCherry體外感染HepG2細胞，在熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白表達以檢測其生物學活性。
　　結果:1.pAAV-FGF21經酶切后，能檢測到兩條帶，分子量分別為5200bp和630bp左右，符合AAV載體片段和FGF21片段大小;pAAV-FGF21-GLP1經酶切后，能檢測到兩條帶，分子量分別為5200bp和780bp左右，符合AAV載體片段和FGF21+GLP1片

3、段大小。2.經pAAV-FGF21轉染后的細胞培養(yǎng)上清中能檢測到FGF-21蛋白;經pAAV-FGF21-GLP1轉染后的細胞培養(yǎng)上清中能檢測到FGF-21蛋白和GLP-1蛋白。3.用rAAV-mCherry感染細胞后可在熒光顯微鏡下觀察到紅色熒光。
　　結論:重組質粒(pAAV-FGF21、pAAV-FGF21-GLP1)構建正確，并且能在體外介導相應目的蛋白的表達。包裝的重組腺相關病毒具有生物學活性。
　　第二章，重組A

4、AV對2型糖尿病小鼠的治療
　　目的:評估rAAV-FGF21、rAAV-FGF21-GLP1對2型糖尿病小鼠的治療效果。
　　方法:對db/db小鼠進行空腹血糖及空腹胰島素測定，以空腹血糖及HOMA-IR升高作為2型糖尿病成模標準。2型糖尿病db/db小鼠隨機分成4組，予以不同處理:A組（生理鹽水）、B組(空載體rAAV-mCherry)、C組(rAAV-FGF21)、D組（rAAV-FGF21-GLP1）;正常C57/B

5、L6小鼠作為H組（生理鹽水）。監(jiān)測各組小鼠空腹血糖、體重、進食量、空腹胰島素。治療10周后處死小鼠，取肝臟組織用RT-PCR檢測目的基因的表達，取胰腺組織用免疫熒光檢測胰島β細胞數量。
　　結果:1.實驗中所有db/db小鼠均有高血糖及胰島素抵抗。2.與A組相比，D組小鼠空腹血糖、體重、進食量、空腹胰島素明顯下降(P＜0.01)，而B組、C組則無明顯變化。3.在C組、D組小鼠肝臟組織中能檢測到相應的轉導目的基因的表達。4.免疫熒光