FGF21的PEG定點(diǎn)修飾及修飾產(chǎn)物性能研究.pdf

1、目的：篩選FGF21的最佳PEG定點(diǎn)化學(xué)修飾條件及最佳分離純化條件，對修飾產(chǎn)物的活性、抗胰蛋白酶穩(wěn)定性、抗熱穩(wěn)定性等生物性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　 方法：根掘影響PEG修飾的5個(gè)主要參數(shù)，即修飾反應(yīng)緩沖液的pH值、FGF21與PEG的摩爾質(zhì)量比、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間、FGF21濃度等，設(shè)計(jì)一系列試驗(yàn)，選擇最優(yōu)的條件組合；在修飾的基礎(chǔ)上，尋找一種有效的分離方法，對修飾混合物進(jìn)行分離，以期得到高純度的PEG-FGF21。根據(jù)修飾前后兩者的分

2、子量的差異：FGF21為19.5kDa，而PEG-FGF21則為40kDa左右，我們嘗試了G-50、S-100等分子篩層析法。在使用分子篩層析法無法進(jìn)行分離之后，我們又嘗試了QFF強(qiáng)陰離子交換法，并且對主要的影響因素如緩沖液的pH、離子強(qiáng)度，洗脫液的pH、離子強(qiáng)度等進(jìn)行了一系列的考察，最終得到了一個(gè)優(yōu)化條件；通過MALDI-TOF質(zhì)譜來檢測是否只有一個(gè)PEG分子修飾到蛋白質(zhì)表明；通過N-端測序來確定FGF21的N-末端是否被PEG所占據(jù)

3、，并結(jié)合MALDI-TOF質(zhì)譜的結(jié)果來判斷在弱酸性條件下，PEG-丁醛是否單一、定點(diǎn)修飾到FGF21的表明；用CD檢測PEG修飾對FGF21的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)有無影響；在此基礎(chǔ)上根據(jù)FGF21能夠刺激3T3-L1脂肪細(xì)胞對葡萄糖的吸收原理，先將3T3-L1前脂肪細(xì)胞經(jīng)過15天的誘導(dǎo)分化成3T3-L1脂肪細(xì)胞，再分別給予等量的FGF21與PEG-FGF21，根據(jù)其攝糖率來評(píng)估FGF21與PEG-FGF21的活性；用2mM的胰蛋白酶于37℃水解

4、FGF21和PEG-FGF21，分時(shí)取樣，SDS-PAGE電泳，并根據(jù)條帶灰度來計(jì)算水解率；用大鼠血清分別溶解FGF21和PEG-FGF21，于37℃保溫，分時(shí)取樣，并用葡萄糖氧化酶-過氧化酶(POD-GOD)法檢測3T3-L1脂肪細(xì)胞吸收培養(yǎng)基中的葡萄糖，計(jì)算細(xì)胞攝取葡萄糖量，并分別跟未經(jīng)加熱處理過的PEG-FGF21、FGF21相比，取比值作圖以考察PEG修飾對FGF21熱穩(wěn)定性的影響；采用ELISA法測定了修飾前后FGF21體內(nèi)半

5、衰期變化情況。
　　 結(jié)果：根據(jù)對影響PEG修飾的5個(gè)主要參數(shù)，即修飾反應(yīng)緩沖液的pH值、FGF21與PEG的摩爾質(zhì)量比、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間、FGF21濃度等條件的考察，得出PEG修飾的最佳條件是：pH為6.0的20mM的PBS緩沖液，F(xiàn)GF21與PEG的質(zhì)量比為1：4，F(xiàn)GF21濃度為1mg/ml，4℃下反應(yīng)8h者為最佳。通過分子排阻試驗(yàn)、強(qiáng)陰離子交換試驗(yàn)，得出的結(jié)論是：分子排阻層析法（G-50、S-100等）無法分離純化得到

6、純度較高的PEG-FGF21，而離子交換(QFF)能夠分離出純度較高的PEG-FGF21，最優(yōu)分離條件是：上樣平衡液為0.1M，pH8.5的Tris緩沖液，洗脫液為80mM的NaCl，pH8.5;MALDI-TOF質(zhì)譜的結(jié)果表明PEGFGF21的分子量為41.3kDa，提示只有一個(gè)PEG分子修飾到FGF21表面；N-端測序結(jié)果為FGF21的前五個(gè)氨基酸為：HPIPD而PEG-FGF21的前五個(gè)循環(huán)結(jié)果都是陰性，則表明PEG特異性修飾到F

7、GF21的N-端α-氨基；CD結(jié)果顯示PEG-FGF21與FGF21紫外吸收的趨勢相同則表明PEG修飾過程對FGF21的空間結(jié)構(gòu)基本上無影響?；钚詳?shù)據(jù)顯示，本研究采用的PEG修飾方法對FGF21的生物學(xué)活性無顯著影響；經(jīng)過PEG修飾后的FGF21無論是血清穩(wěn)定性還是抗胰蛋白酶水解能力均得到了較大程度的提高；另外，體內(nèi)半衰期結(jié)果表明，F(xiàn)GF21經(jīng)過PEG修飾后體內(nèi)半衰期提高了將近6倍。
　　 結(jié)論：本研究獲得了一種穩(wěn)定高效的FGF