一步法復(fù)發(fā)及PEG修飾及其修飾產(chǎn)物的性能研究.pdf

1、目的:建立一種新型的工藝路線，將蛋白復(fù)性與蛋白PEG修飾整合為一步，即同步復(fù)性與修飾，從而一步從包涵體蛋白得到高修飾率、高特異性、高純度的PEG修飾蛋白，改善傳統(tǒng)蛋白復(fù)性與PEG化學(xué)修飾步驟繁瑣的缺陷。
　　方法:配制不同濃度的溶菌酶(20mM PB，pH7.0)溶液，RP-HPLC測(cè)定各溶液的洗脫峰。以溶菌酶濃度為橫坐標(biāo)，洗脫峰面積為縱坐標(biāo)，建立溶菌酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密稱取25mg溶菌酶加入到2.5ml的蛋白變性液中(20mM P

2、B，8M尿素，100mM DTT，pH7.0)使其終濃度為10 mg/mL，室溫放置4h待其變性。通過RP-HPLC確定其變性完全后用PD脫鹽柱將溶菌酶中的DTT脫除;變性后的溶菌酶加入到含PEG的復(fù)性緩沖液中(4 mM EDTA，1 mM GSSG，10 mM GSH，1.5 Murea，pH6.0，30mM NaBH3CN)，分別在2、4、8、12和24h取樣待測(cè)，取樣后加入2％甘氨酸終止反應(yīng)。通過12％ SDS-PAGE與RP-H

3、PLC來摸索同步復(fù)性修飾的最佳反應(yīng)條件并詳細(xì)分析同步復(fù)性修飾的具體過程。我們對(duì)影響蛋白復(fù)性與液相PEG修飾反應(yīng)的2個(gè)主要參數(shù):即反應(yīng)過程中緩沖液的pH值和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。IEC（離子交換色譜）分析不同反應(yīng)時(shí)間的同步復(fù)性與修飾產(chǎn)物，運(yùn)用溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)曲線與RP-HPLC分析同步復(fù)性與修飾過程中復(fù)性率和修飾率隨時(shí)間的變化，反應(yīng)結(jié)束后用無鹽緩沖液將修飾蛋白混合液上樣到預(yù)先平衡的離子交換色譜柱(IEC)，上樣流速為0.5 mL/min，上樣結(jié)束

4、后用無鹽緩沖液沖下未與柱結(jié)合的雜質(zhì)，然后分別用含0.2 M NaCl與1.0 M NaCl的緩沖液將未修飾的溶菌酶與修飾后的溶菌酶依次洗脫下來。運(yùn)用MALDI-TOF質(zhì)譜測(cè)定修飾產(chǎn)物的分子量;CD圓二色譜對(duì)比野生溶菌酶與PEG-LYS的二級(jí)結(jié)構(gòu)是否存在差異;融壁微球菌檢測(cè)溶菌酶同步復(fù)性修飾后的活性變化。
　　結(jié)果:以溶菌酶為模型蛋白實(shí)施同步復(fù)性與修飾，SDS-PAGE結(jié)果說明一步法成功的對(duì)溶菌酶進(jìn)行聚乙二醇修飾，通過RP-HPLC

5、證明了同步復(fù)性與修飾所得PEG修飾率與天然溶菌酶修飾率基本一致;采用IEC分析不同反應(yīng)時(shí)間同步復(fù)性與修飾所得產(chǎn)物，結(jié)果表明在此過程中蛋白復(fù)性和蛋白PEG修飾同步完成。RP-HPLC對(duì)比分析野生型溶菌酶/復(fù)性溶菌酶/天然溶菌酶修飾和同步復(fù)性與修飾所得溶菌酶，結(jié)合溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算未修飾復(fù)性溶菌酶和修飾溶菌酶含量隨時(shí)間的變化，由RP-HPLC結(jié)合溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)曲線作圖可以看出在反應(yīng)進(jìn)行8h之前，復(fù)性溶菌酶和PEG修飾溶菌酶的含量均隨著時(shí)間在增加

6、;反應(yīng)時(shí)間超過8h后，PEG修飾溶菌酶含量依然升高，復(fù)性溶菌酶含量降低，這可能是由于蛋白復(fù)性接近飽和，先前累積的復(fù)性溶菌酶轉(zhuǎn)化為PEG修飾溶菌酶。結(jié)果證實(shí)同步復(fù)性與修飾方法在不影響其復(fù)性率的同時(shí)，確實(shí)同步完成了溶菌酶的復(fù)性以及其PEG修飾。MALDI-TOF質(zhì)譜和圓二色譜對(duì)PEG-LYS進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，MALDI-TOF質(zhì)譜的結(jié)果表明PEG-LYS的分子量為35754Da，提示只有一個(gè)PEG分子修飾到蛋白表面;CD結(jié)果顯示PEG-LYS與