沼澤型水牛乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)體系建立及永生化研究.pdf

1、本研究目的是構(gòu)建永生化的水牛乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，為今后研究水牛乳腺組織發(fā)育和泌乳生理功能調(diào)控機(jī)理奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)以泌乳期沼澤型水牛的乳腺組織為材料，進(jìn)行了如下研究： 實(shí)驗(yàn)一，探討了水牛乳腺上皮細(xì)胞分離、純化培養(yǎng)方法及細(xì)胞的特性。選取處于泌乳期沼澤型水牛的乳腺組織分別采用組織塊接種法和酶消化法分離培養(yǎng)原代水牛乳腺上皮細(xì)胞。利用乳腺上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的敏感性不同和細(xì)胞貼壁時(shí)間差進(jìn)行分離純化，獲得純?nèi)橄偕掀ぜ?xì)胞。形態(tài)觀

2、察發(fā)現(xiàn)純化后乳腺上皮細(xì)胞呈鵝卵石狀，具有典型上皮細(xì)胞的形態(tài)特征；染色體核型分析表明，染色體數(shù)目48(2n)條，與沼澤型水牛染色體數(shù)目相符；熒光免疫細(xì)胞染色法表明，培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞具有角蛋白-8的特異性表達(dá)，且在雌二醇激素的誘導(dǎo)下能表達(dá)出a-酪蛋白。 實(shí)驗(yàn)二，探討了水牛乳腺上皮細(xì)胞永生化的方法。利用實(shí)驗(yàn)一所獲得的水牛乳腺上皮細(xì)胞系，采用DNA-磷酸鈣沉淀轉(zhuǎn)染法，將SV40質(zhì)粒轉(zhuǎn)染純化后第4代的水牛乳腺上皮細(xì)胞，經(jīng)過篩選后繼續(xù)培養(yǎng)

3、，細(xì)胞的輪廓變大，但生長(zhǎng)速度無明顯改變(差異不顯著，P>0.05)，到目前為止細(xì)胞總共已傳了15代，細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好。經(jīng)過端粒重復(fù)序列擴(kuò)增(TRAP)-銀染法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的端粒酶活性，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的端粒酶活性要比未轉(zhuǎn)染前的高。 實(shí)驗(yàn)三，探討了雌激素受體α、催乳素受體在永生化水牛乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)情況和不同濃度雌二醇對(duì)水牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響。根據(jù)NCBI上發(fā)表的奶牛雌激素受體α基因和催乳素受體基因cDNA序列，設(shè)計(jì)

4、兩對(duì)特異性引物，用RT-PCR從永生化水牛乳腺上皮細(xì)胞系擴(kuò)增水牛雌激素受體α基因和催乳素受體基因部分序列。結(jié)果擴(kuò)增出雌激素受體α基因序列為171bp，催乳素受體基因序列為253bp，與奶牛的同源性分別為100％和99.2％。證實(shí)了永生化水牛乳腺上皮細(xì)胞與原代細(xì)胞一樣，仍能表達(dá)雌激素受體和催乳素受體。采用MTT法檢測(cè)不同濃度雌二醇對(duì)水牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果得到濃度為5mg/L處理組的增殖效果最佳，差異顯著(P<0.05)。

5、 以上結(jié)果表明：(1)用組織塊接種法比酶消化法更易獲得原代的水牛乳腺上皮細(xì)胞；(2)經(jīng)過熒光免疫細(xì)胞染色、α-酪蛋白PCR鑒定和染色體核型分析證實(shí)所獲得的細(xì)胞為水牛乳腺上皮細(xì)胞，且具有正常分泌酪蛋白的功能；(3)通過DNA-磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染使SV40在水牛乳腺上皮細(xì)胞中得到表達(dá)，細(xì)胞的端粒酶活性高于未轉(zhuǎn)染前，成功建立了永生化沼澤型水牛乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)體系；(4)經(jīng)過SV40轉(zhuǎn)染后水牛乳腺上皮細(xì)胞仍表達(dá)雌激素受體α和催乳素受體；(5)