近江牡蠣類立克次體與宿主相互作用的分子生物學(xué)研究.pdf

1、宿主與病原的相互作用是國際微生物感染免疫學(xué)前沿領(lǐng)域的重要命題。類立克次體是一類嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性微生物,導(dǎo)致養(yǎng)殖牡蠣的大量死亡,但對于其分子生物學(xué)和致病機(jī)理知之甚少。本研究主要采用類立克次體菌體細(xì)胞和外膜蛋白誘導(dǎo)刺激近江牡蠣宿主,系統(tǒng)探索了類立克次體病原與宿主的相互作用:即類立克次體菌體細(xì)胞誘導(dǎo)宿主核轉(zhuǎn)錄因子CREB,LITAF的免疫功能與機(jī)理及類立克次體外膜蛋白o(hù)mpR誘導(dǎo)刺激后宿主的分子免疫反應(yīng)機(jī)制以及信號傳導(dǎo)途徑。

2、　　 取類立克次體誘導(dǎo)刺激后的近江牡蠣血淋巴細(xì)胞,采用TRIzol法提取RNA,制備cDNA模板。根據(jù)CREB蛋白的保守結(jié)構(gòu)特征設(shè)計了兼并寡聚核苷酸引物,采用RT-PCR.和RACE PCR技術(shù)首次在雙殼貝類中獲得了Ca-CREB的全長cDNA序列。該cDNA序列含有一個1068 bp的讀碼框,編碼一個39.3 kDa的蛋白,該蛋白具有轉(zhuǎn)錄因子CREB的特征性結(jié)構(gòu),與無脊椎動物海兔和蝸牛的CREB同源性較高,相似度分別為56％和58％

3、。組織半定量RT-PCR結(jié)果表明:Ca-CREB在各組織中均有表達(dá),但在血細(xì)胞和鰓中的表達(dá)量明顯高于其它組織,預(yù)示該基因可能與免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。通過構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-CREB,在大腸桿菌中對Ca-CREB進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)、蛋白純化并制備了多克隆抗體,同時利用凝膠阻滯技術(shù)(EMSA)對重組蛋白的活性進(jìn)行了研究。隨后采用Real time RT-PCR、Westernblotting和EMSA技術(shù)探討了Ca-CREB在類立克次體誘導(dǎo)刺激條件

4、下的激活機(jī)理及功能。結(jié)果表明:①Ca-CREB在大腸桿菌中得到了高效表達(dá),獲得的重組蛋白具有特異的DNA結(jié)合活性,制備的兔多克隆抗體的效價為1:12000。②在類立克次體誘導(dǎo)刺激不同時間段內(nèi),血淋巴細(xì)胞中Ca-CREB的基因表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異,而Ca-CREB的DNA結(jié)合活性和磷酸化水平得到了明顯提高,這表明核轉(zhuǎn)錄因子Ca-CREB在類立克次體誘導(dǎo)的宿主免疫反應(yīng)中具有功能,且這種功能的激活發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平上。接著,我們分別從表達(dá)載體、

5、膠濃度及電泳條件等方面著手,對Ca-CREB原核表達(dá)產(chǎn)物比預(yù)測蛋白分子量偏大的原因進(jìn)行了分析,結(jié)果表明:不同的表達(dá)載體及膠濃度對Ca-CREB融合蛋白在SDS-PAGE中表現(xiàn)的分子量大小沒有影響,而不同SDS-PAGE體系分離融合蛋白時產(chǎn)生了融合分子量偏小的現(xiàn)象,推測不同的SDS-PAGE體系與分子量偏差的產(chǎn)生有關(guān)。
　　 鑒于類立克次體在菌體細(xì)胞水平上能夠誘導(dǎo)刺激宿主發(fā)生上述免疫反應(yīng),為深入探討類立克次體在蛋白分子水平上是否能

6、夠誘導(dǎo)刺激宿主的分子免疫反應(yīng)機(jī)制及信號傳導(dǎo)途徑,本實(shí)驗(yàn)通過基因組測序方法獲得了首個貝類類立克次體病原的外膜蛋白o(hù)mpR基因并研究了其免疫功能。該基因全長531bp,編碼176個氨基酸,預(yù)測的蛋白分子量和等電點(diǎn)分別為19.76 Kda和9.76。核酸和氨基酸序列分析表明該蛋白具有細(xì)菌外膜蛋白的特征,與人Q熱立克次體和潮蟲立克次體外膜蛋白o(hù)mpH具有20％-27％的相似性。隨后以上述同樣方法進(jìn)行了ompR重組蛋白的表達(dá)、純化和多克隆抗體的制

7、備。在功能研究上,采用實(shí)時定量PCR、EMSA.等技術(shù)手段分析了ompR誘導(dǎo)刺激后,宿主多個免疫相關(guān)因子的免疫反應(yīng)機(jī)制及信號傳導(dǎo),結(jié)果顯示:①該蛋白得到了成功地表達(dá),制備的多克隆抗體與近江牡蠣類立克次體的總外膜蛋白產(chǎn)生了特異性的免疫反應(yīng),在目的蛋白位置出現(xiàn)了單一的免疫反應(yīng)條帶,表明已經(jīng)獲得了類立克次體外膜蛋白o(hù)mpR。②ompR誘導(dǎo)刺激后,宿主免疫相關(guān)因子Myd88和TNF-α的表達(dá)水平發(fā)生了明顯變化,而TGF-β基因的表達(dá)水平不受影響

8、;在轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控表現(xiàn)為刺激后血淋巴細(xì)胞中P38的磷酸化水平明顯地增加,JNK的磷酸化水平急劇下降,而ERK的磷酸化水平無變化;同時核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的DNA結(jié)合活性的明顯增加,而P38激酶抑制劑可顯著地抑制該結(jié)合活性。
　　 在前面研究基礎(chǔ)上,我們進(jìn)一步克隆鑒定了近江牡蠣的LITAF(LPS-inducedTNF-α),并對其功能進(jìn)行了初步研究。Ca-LITAF全長750 bp,具有一個348 bp的讀碼框,編碼一個分子

9、量大小約為12.5 kDa的蛋白。該蛋白具有Zn2+結(jié)合區(qū)(CXXC和HXCXXC)和LITAF結(jié)構(gòu)域等特征性結(jié)構(gòu),與其它動物的LITAF蛋白的相似度介于33％和96％之間,其中與無脊椎動物太平洋長牡蠣和扇貝的LITAF蛋白具較高同源性,同屬一個亞群。實(shí)時定量PCR結(jié)果顯示:Ca-LITAF在各被檢組織中均有表達(dá),在鰓和血淋巴細(xì)胞的表達(dá)量要高于其它組織,類立克次體誘導(dǎo)刺激后血淋巴細(xì)胞中Ca-LITAF的表達(dá)明顯增強(qiáng),表明Ca-LITAF