立克次體分子生物學(xué)檢測方法建立及云南紅塔立克次體感染情況調(diào)查.pdf

1、立克次體(Rickettsias)為原核細(xì)胞型、革蘭染色陰性的專性細(xì)胞內(nèi)寄生菌。分類學(xué)屬于變形綱立克次體目(Rickettsiales)，下屬的立克次體科包括立克次體屬(Rickettsia)、恙蟲病東方體屬(Orientiatsutsugamushf)、埃立克體屬(Ehrlichiea)，其中立克次體屬又分為斑疹傷群寒、斑點(diǎn)熱群，自然界已發(fā)現(xiàn)有20余種對人類致病。近年新病種和新疫區(qū)不斷被發(fā)現(xiàn)，立克次體病已成為世界性關(guān)注的疾病。由于非特

2、異的臨床表現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)室診斷成為主要依據(jù)。目前PCR方法已被廣泛用于立克次體的實(shí)驗(yàn)室診斷，但多數(shù)方法只針對單個(gè)屬或種特異，靈敏度往往也達(dá)不到實(shí)際檢測要求。為提供更快速、靈敏的檢測方法，本研究以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，應(yīng)用克隆、測序及序列分析等分子生物學(xué)、生物信息學(xué)手段建立靈敏、特異地立克次體屬和恙蟲病東方體屬多種屬立克次體的檢測方法，并應(yīng)用此方法對自然界鼠宿主、媒介生物、臨床病人標(biāo)本進(jìn)行檢測、產(chǎn)物測序、序列分析等研究。獲得了以下結(jié)果： 1

3、 以PCR為基礎(chǔ)的多種屬立克次體檢測方法建立根據(jù)立克次體屬和恙蟲病東方體屬熱休克蛋白編碼基因(groEL)的保守區(qū)設(shè)計(jì)外引物，以文獻(xiàn)屬特異引物對為內(nèi)引物組成巢式PCR。通過產(chǎn)物片段大小、測序或PCR-RFLP鑒定不同屬、種甚至不同型別立克次體。特異性地?cái)U(kuò)增立克次體屬和恙蟲病東方體屬立克次體DNA，每個(gè)反應(yīng)可檢測到1×10<'1>拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)模板，比普通PCR靈敏度提高10倍。適于地方性斑疹傷寒、流行性斑疹傷寒、斑點(diǎn)熱和恙蟲病地同時(shí)檢測。

4、 2 方法的應(yīng)用對從云南省玉溪市紅塔區(qū)收集的各鼠肝臟、脾臟及部分鼠全血，鼠蚤、螨及病人標(biāo)本進(jìn)行g(shù)roEL基因巢式PCR檢測。34.78﹪的鼠有陽性擴(kuò)增，斑疹傷寒、恙蟲病和斑點(diǎn)熱擴(kuò)增陽性率分別為28.12﹪、19．13﹪、0.29﹪。從蚤提取的DNA中擴(kuò)增到斑疹傷寒片段，從螨提取的DNA中擴(kuò)增到恙蟲病片段。8例可疑立克次體病病人血標(biāo)本中，4例擴(kuò)增出斑疹傷寒片段，其中1例同時(shí)擴(kuò)增出恙蟲病片段。部分產(chǎn)物序列比較分析發(fā)現(xiàn)斑疹傷寒、恙蟲病和

5、班點(diǎn)熱片段序列分別與GeneBank中已知的莫氏立克次體(R.typhf)W、87-100、Ethiopian AZ322株，恙蟲病(O.t)Karp型和西伯利亞立克次體(R.sibirica)核苷酸和推定氨基酸同源性最高，多數(shù)100﹪同源，21株斑疹傷寒和恙蟲病產(chǎn)物核苷酸序列有堿基替換，呈99﹪同源，其中7株推定的氨基酸序列有替換突變，呈99﹪，98﹪同源。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(Indirect fluorescent antibody

6、test，IFA)鼠血清R．typhi W株、康氏立克次體(R．conorif)、O.t，Karp型、Kato型、Gilliam型抗體陽性率分別為41.36﹪、31.82﹪、35.45﹪、31.36﹪、25.91﹪。從分子生物學(xué)和血清學(xué)方面證實(shí)了紅塔區(qū)有地方性斑疹傷寒、恙蟲病及班點(diǎn)熱的流行，有地方性斑疹傷寒和恙蟲病的核苷酸和氨基酸突變株存在。各鎮(zhèn)鼠標(biāo)本地方性斑疹傷寒和恙蟲病擴(kuò)增陽性率均有顯著性差異(P<0.05)，血清R.typhi、O

7、.t，Karp型、Kato型IgG抗體陽性率也均有顯著性差異(P<0.05)，各鎮(zhèn)鼠標(biāo)本斑點(diǎn)熱擴(kuò)增陽性率及血清R.conori和O．t Gilliam IgG抗體陽性率均無顯著性差異(P>0.05)。斑點(diǎn)熱在洛河鄉(xiāng)以外的其它鄉(xiāng)鎮(zhèn)有流行，地方性斑疹傷寒和恙蟲病疫源地范圍已擴(kuò)大到全區(qū)，地方性斑疹傷寒在研和鎮(zhèn)、春和鎮(zhèn)、北城鎮(zhèn)、州城有高度流行，恙蟲病在全區(qū)各鄉(xiāng)鎮(zhèn)均有高度流行。 PCR檢測發(fā)現(xiàn)1位病人和13.33﹪的鼠標(biāo)本有地方性斑疹傷寒