近江牡蠣天然免疫相關(guān)蛋白的分子生物學(xué)及功能研究.pdf

1、牡蠣等無脊椎動(dòng)物的天然免疫相關(guān)蛋白及其與病原的相互作用是國(guó)際病害與分子免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)問題。類立克次體是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性細(xì)菌,可引起牡蠣的大規(guī)模死亡,但目前在貝類抗RLO感染機(jī)理方面所知甚少。本博士學(xué)位論文在對(duì)近江牡蠣天然免疫相關(guān)蛋白的基因(sTRAIL,Tolloid-like,MAK3和p38)和/或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子生物學(xué)進(jìn)行研究的基礎(chǔ)上,對(duì)它們的功能進(jìn)行了研究,即:一方面采用類立克次體對(duì)近江牡蠣宿主進(jìn)行誘導(dǎo)刺激,系統(tǒng)

2、地分析了宿主與類立克次體病原的相互作用:即牡蠣sTRAIL,Tolloid-like,MAK3和p38在類立克次體誘導(dǎo)的宿主免疫反應(yīng)中的功能、作用機(jī)制,以及sTRAIL在免疫反應(yīng)中的信號(hào)傳導(dǎo)通路。另一方面本研究系統(tǒng)地探索研究了sTRAIL對(duì)牡蠣正常血淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用及其作用機(jī)制和信號(hào)傳導(dǎo)通路。一、關(guān)于近江牡蠣sTRAIL促細(xì)胞凋亡及抗類立克次體感染免疫的研究
　　 取近江牡蠣血淋巴細(xì)胞,采用TRIzol法提取總RN

3、A,制備cDNA模板。根據(jù)人和不同動(dòng)物TRAIL基因序列設(shè)計(jì)引物,采用RT-PCR技術(shù)首次在雙殼貝類中獲得了CaSTRAIL的編碼序列。該cDNA序列含有一個(gè)501 bp的讀碼框,編碼一個(gè)18.4kDa的蛋白,該蛋白含有一個(gè)典型的TNF結(jié)構(gòu)域。CasTRAIL與人的TRAIL基因同源性較高,兩者的cDNA序列同源性為99％,氨基酸序列的同源性為98％；與草魚的同源性則較低,為42％。各組織原位雜交和RT-PCR結(jié)果表明:CasTRAIL

4、在牡蠣各正常組織中均有表達(dá),在外套膜、血淋巴和鰓中表達(dá)量較高,性腺中表達(dá)量很低,提示該基因可能與免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。通過構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-CasTRAIL,在大腸桿菌中對(duì)CasTRAIL進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá),并純化蛋白制備了多克隆抗體；同時(shí),利用該抗體對(duì)牡蠣TRAIL的亞細(xì)胞定位進(jìn)行了研究:結(jié)果表明CasTRAIL在大腸桿菌中得到了高效表達(dá),所制備的兔多克隆抗體的效價(jià)為1:4000；牡蠣TRAIL蛋白主要表達(dá)于血淋巴細(xì)胞的細(xì)胞膜上,是一個(gè)跨膜

5、蛋白。隨后利用Real time RT-PCR、流式細(xì)胞儀、DNA電泳、Western blotting和抗體技術(shù)等探索研究了CasTRAIL對(duì)牡蠣正常血淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用及其作用機(jī)制和信號(hào)傳導(dǎo)通路。結(jié)果證明:CasTRAIL可通過激活死亡受體(DR4和DRS)途徑引起人類腫瘤細(xì)胞HL-60的凋亡；對(duì)正常牡蠣血淋巴紐胞無毒性,但可引起p38和ERK等磷酸化水平的提高,表明MAPKs與CasTRAIL信號(hào)傳導(dǎo)的和功能有關(guān)。接著

6、,利用原位雜交、Real time RT-PCR技術(shù)探索研究了CaSTRAIL在類立克次體誘導(dǎo)刺激條件下的激活機(jī)理及其功能。結(jié)果顯示:CasTRAIL在外套膜、血淋巴和肌肉中明顯增強(qiáng),在鰓中顯著降低,而在性腺中則未見明顯變化,表明CasTRAIL在類立克次體誘導(dǎo)的宿主免疫反應(yīng)中具有功能。二、類立克次體誘導(dǎo)刺激后近江牡蠣Tolloid-like、MAK3和p38MAPK基因的克隆與鑒定
　　 我們進(jìn)一步克隆鑒定了近江牡蠣的Toll

7、oid-like,MAK3和p38基因,并對(duì)它們的功能進(jìn)行了初步研究。①CaTLL全長(zhǎng)3492 bp,具有一個(gè)2811 bp的讀碼框,編碼含936個(gè)氨基酸、分子量大小約103 kDa的蛋白,該蛋白含有蝦紅素超家族成員幾個(gè)特征性結(jié)構(gòu)域或基序:astacin-like結(jié)構(gòu)域、按CUB-CUB-EGF-CUB-EGF-CUB-CUB排列的CUBs和EGFs結(jié)構(gòu)域、RTRR基序、zn2+結(jié)合基序:HELGHVIGFWHEH和Met-turn:S

8、IMHY。其中astacin-like結(jié)構(gòu)域與其它動(dòng)物該結(jié)構(gòu)域的相似度在30％-97％之間,提示其催化功能的保守性。RT-PCR結(jié)果顯示:CaTLL在各正常組織中均有表達(dá),在鰓中的表達(dá)量較高,在血淋巴細(xì)胞中的表達(dá)量顯著偏低；而實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示:類立克次體誘導(dǎo)刺激后血淋巴細(xì)胞中CaTLL的表達(dá)明顯增強(qiáng),表明CaTLL與RLO誘導(dǎo)的宿主免疫反應(yīng)有關(guān)。②CaMAK3基因的編碼序列長(zhǎng)510bp,具有一個(gè)510 bp的完整讀碼框,編碼169

9、個(gè)氨基酸、分子量大小約18.6 kDa的蛋白,該蛋白的特征性結(jié)構(gòu)域Acetyltransf1與酵母菌的相似度為27％；與各種動(dòng)物的相似度在53％-100％之間,是一個(gè)非常保守的結(jié)構(gòu)域。RT-PCR結(jié)果顯示:CaMAK3在各正常組織中均有表達(dá),其中鰓和血淋巴細(xì)胞中表達(dá)量較高,外套膜和閉殼肌中的表達(dá)量較低；而在類立克次體誘導(dǎo)刺激后血淋巴細(xì)胞中的表達(dá)明顯增強(qiáng),表明CaMAK3與RLO誘導(dǎo)的宿主免疫反應(yīng)有關(guān)。③Cap38全長(zhǎng)1244 bp,含有

10、一個(gè)1065 bp的完整讀碼框,編碼355個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),其分子量近39 kDa。該蛋白含有一個(gè)保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域S_TKc,該結(jié)構(gòu)域和其它動(dòng)物的相似度在62％和77％之間,說明p38蛋白是一個(gè)較保守的激酶。RT-PCR結(jié)果顯示:p38在各組織中均有表達(dá),其中鰓、血淋巴細(xì)胞和外套膜中表達(dá)量較高；而在類立克次體誘導(dǎo)刺激后血淋巴細(xì)胞中Cap38的表達(dá)水平在15min后即迅速增至峰值,表明Cap38在RLO誘導(dǎo)的宿主免疫

11、反應(yīng)中具有一定作用。
　　 綜合上述結(jié)果得到如下結(jié)論:CasTRAIL在類立克次體誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)中,類立克次體可以誘導(dǎo)增強(qiáng)CasTRAIL的表達(dá)水平,證明了CasTRAIL具有免疫功能,且CasTRAIL重組蛋白誘導(dǎo)試驗(yàn)證明CasTRAIL可從mRNA和蛋白兩個(gè)水平上同時(shí)激活p38-MAPK的表達(dá),表明在CasTRAIL介導(dǎo)的抗類立克次體感染的免疫反應(yīng)中,可能和p38-MAPK介導(dǎo)的信號(hào)通路有關(guān)；而Tolloid-like,MA

12、K3和p38等基因在類立克次體誘導(dǎo)的宿主免疫反應(yīng)中都具有一定的功能。鑒于這些結(jié)果,病原/TRAIL/MAPKs/信號(hào)途徑可能存在于牡蠣天然免疫系統(tǒng)中,而Tolloid-like,MAK3可能在對(duì)該信號(hào)途徑進(jìn)行調(diào)節(jié)、修飾等方面發(fā)揮一定作用,從而共同抵御外來病原的入侵。另外,通過檢測(cè)p38,ERK,JNK等MAPks激酶磷酸化水平的變化,證明CasTRAIL蛋白對(duì)正常血淋巴細(xì)胞無毒性作用,但對(duì)人類的腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用,可引起腫瘤細(xì)胞HL