Wnt信號(hào)通路參與中腦多巴胺神經(jīng)元損傷的研究.pdf

1、經(jīng)典Wnt信號(hào)通路在中腦多巴胺神經(jīng)元發(fā)育的過(guò)程中至關(guān)重要，一些研究提示這條通路可能與帕金森病(Parkinson'disease，PD)發(fā)病相關(guān)，但都一致缺乏基因敲除小鼠的證據(jù)。Wnt信號(hào)通路中重要的分子包括低密度脂蛋白5（LRP5）、低密度脂蛋白6（LRP6）、β-catenin。LRP5/6是Wnt信號(hào)通路中共受體，能分別與Wnt-fzd形成三聚物。β-catenin是調(diào)控Wnt信號(hào)通路的重要分子，有研究發(fā)現(xiàn)β-catenin在中腦

2、DA神經(jīng)元發(fā)育中不可或缺。本實(shí)驗(yàn)采用cre-loxp策略制備DA神經(jīng)元內(nèi)選擇性敲除LRP5，LRP6和β-catenin的條件性基因敲除(CKO)小鼠。首先，通過(guò)地高辛標(biāo)記的β-catenin原位雜交探針，檢測(cè)了β-catenin mRNA在黑質(zhì)區(qū)域的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，β-catenin mRNA陽(yáng)性細(xì)胞在對(duì)照組正常小鼠中腦黑質(zhì)致密帶(SNc)處有表達(dá)。而β-catenin CKO小鼠該區(qū)域的原位雜交信號(hào)明顯下降。因此，原位雜交表明β

3、-catenin CKO小鼠的中腦黑質(zhì)內(nèi)β-catenin明顯下降，一些殘存的信號(hào)可以是非多巴胺神經(jīng)表達(dá)的β-catenin。由于LRP5 mRNA和LRP6 mRNA原位雜交信號(hào)廣泛分布，信號(hào)較弱。因此我們采用免疫組化方法對(duì)敲除效率進(jìn)行驗(yàn)證。市售的抗體同時(shí)識(shí)別LRP5和LRP6，因此對(duì)三組小鼠（LRP5 CKO，LRP6 CKO和LRP5/LRP6雙重CKO）進(jìn)行了驗(yàn)證。正常對(duì)照組小鼠黑質(zhì)LRP5/LRP6陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)，大量與TH陽(yáng)性細(xì)

4、胞共標(biāo)。LRP5/LRP6雙重CKO小鼠黑質(zhì)處LRP5/LRP6無(wú)陽(yáng)性表達(dá)，與黑質(zhì)TH陽(yáng)性細(xì)胞不共標(biāo)。與正常組小鼠相比，LRP5 CKO與LRP6 CKO小鼠LRP5/LRP6陽(yáng)性信號(hào)減弱，與TH陽(yáng)性細(xì)胞共標(biāo)的細(xì)胞減少。本結(jié)果間接證明LRP5 CKO和LRP6 CKO黑質(zhì)內(nèi)上述基因被敲除。驗(yàn)證LRP5，LRP6和β-catenin成功敲除后，再通過(guò)免疫組織化學(xué)方法觀察這三種CKO小鼠，成年時(shí)期中腦黑質(zhì)內(nèi)酪氨酸羥化酶(Tyrosinehy

5、droxylase，TH)免疫反應(yīng)陽(yáng)性數(shù)量是否發(fā)生改變。發(fā)現(xiàn)LRP5，LRP6缺失后小鼠中腦DA神經(jīng)元的數(shù)量沒(méi)有改變，而β-catenin敲除的小鼠中腦DA神經(jīng)元的數(shù)量下降，由此驗(yàn)證β-catenin參與DA神經(jīng)元發(fā)育的觀點(diǎn)。繼而在這些小鼠上進(jìn)行PD發(fā)病的環(huán)境損害因素的測(cè)試，采用的方法是腹腔注射神經(jīng)毒素1-甲基-4苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)15mg/kg，每日一次，持續(xù)注射5周后，正常小鼠組、LRP5 CKO小鼠組和LR

6、P6 CKO小鼠組黑質(zhì)TH-陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量均降低。但是LRP5和LRP6 CKO小鼠TH陽(yáng)性細(xì)胞下降的程度低于MPTP處理的正常對(duì)照小鼠。此結(jié)果提示在中腦DA神經(jīng)元中特定敲除LRP5和LRP6在一定程度上保護(hù)了DA神經(jīng)元抵抗神經(jīng)毒MPTP的損害。另外，雖然β-catenin CKO小鼠黑質(zhì)DA神經(jīng)元的數(shù)量在生理鹽水處理時(shí)就比較少，但是經(jīng)MPTP處理后β-cateninCKO小鼠黑質(zhì)DA神經(jīng)的數(shù)量卻與正常小鼠相當(dāng)。表明β-catenin缺