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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:研究白藜蘆醇(Resveratrol,Res)對(duì)血管鈣化的抑制作用,觀(guān)察不同濃度的Res對(duì)高鈣、高磷誘導(dǎo)的人血管平滑肌細(xì)胞(hVSMC)成骨樣轉(zhuǎn)化的影響。為終末期腎病(ESRD)患者血管鈣化的預(yù)防提供一定的依據(jù)。
方法:1.無(wú)菌條件下取胎兒(男嬰,足月)臍帶,剝離臍動(dòng)脈,無(wú)菌PBS清洗,剝除外膜,胰酶消化法提取臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞,體外培養(yǎng)人臍動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞,通過(guò)形態(tài)學(xué)和α-SMA標(biāo)記進(jìn)行平滑肌細(xì)胞鑒定。根據(jù)培養(yǎng)液中含鈣
2、磷濃度分為陰性對(duì)照組(NC)及實(shí)驗(yàn)組(PC),實(shí)驗(yàn)組根據(jù)白藜蘆醇的濃度分為實(shí)驗(yàn)組1(T1,5μ mol/L Res)、實(shí)驗(yàn)組2(T2,10μ mol/LRes)、實(shí)驗(yàn)組3(T3,20μ mol/L Res)。各組培養(yǎng)12天,2-3天換液1次。
2.用含高鈣、高磷(Ca2+:2.5mmol/L,P:3.0mmol/L)的培養(yǎng)基誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的成骨樣轉(zhuǎn)化,通過(guò)茜紅素染色法于形態(tài)學(xué)上鑒定平滑肌細(xì)胞的成骨樣轉(zhuǎn)化。培養(yǎng)12天后,采用偶氮
3、胂Ⅲ檢測(cè)各組細(xì)胞鈣含量,對(duì)平滑肌細(xì)胞的鈣化進(jìn)行定量檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組hVSMC成骨樣轉(zhuǎn)化相關(guān)基因BAP、BMP2、OPN的表達(dá)水平,Western blot和免疫熒光標(biāo)記方法檢測(cè)各組BMP2、OPN的表達(dá)水平。
3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS18.0對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用(x)±s表示,符合正態(tài)分布且方差齊性的數(shù)據(jù),組間資料比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析, P
4、<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果:1.原代細(xì)胞鑒定:倒置顯微鏡下平滑肌細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或多邊形,細(xì)胞生長(zhǎng)呈“峰-谷樣”。免疫組化α-SMA染色見(jiàn)細(xì)胞胞漿內(nèi)α-SMA表達(dá)豐富,高倍鏡下呈細(xì)絲狀。
2.與陰性對(duì)照組比較,高鈣、高磷組的細(xì)胞層見(jiàn)顆粒樣沉積,茜紅素染色見(jiàn)橘紅色團(tuán)塊狀沉積,鈣含量檢測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)組鈣含量明顯增加,達(dá)5倍(P<0.05),其α-SMA蛋白質(zhì)表達(dá)下降,而成骨樣細(xì)胞特異性標(biāo)記BAP、BMP2、OPN mRNA和
5、蛋白質(zhì)表達(dá)均顯著升高(P<0.05)。平滑肌細(xì)胞鈣化模型成功建立。
3.不同濃度Res干預(yù)后,與高鈣、高磷組比較,T1、T2、T3組細(xì)胞內(nèi)鈣含量下降, BAP、 BMP2、 OPN mRNA水平降低;BMP2及OPN的蛋白質(zhì)表達(dá)顯著降低,并與Res濃度呈負(fù)相關(guān)。
4.免疫熒光檢測(cè)結(jié)果同樣證實(shí):與對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組OPN、BMP2的表達(dá)升高,與Res干預(yù)后,隨Res濃度升高,OPN、BMP2的表達(dá)逐漸下降。
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