表達抗G250人源性抗體的增殖缺陷腺病毒構(gòu)建.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的：構(gòu)建表達抗G250人源性抗體的增殖缺陷型腺病毒。
　　 方法：1．以pUC57-VH、pAT4-CH為模板，通過重疊延伸PCR方法，將G250重鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)基因序列連接并在兩端加入BamHI、XhoI酶切位點，切膠回收PCR產(chǎn)物，酶切后克隆進pUC19的相應(yīng)位點，構(gòu)建pUC19-GH并測序。2．質(zhì)粒pUC19-GH經(jīng)BamHI/XhoI雙酶切，得到GH片段，連接到帶有IRES（內(nèi)部核糖體進入位點）的pCLON12質(zhì)粒

2、相應(yīng)位點，構(gòu)建pCLON12-GH并測序。3.以pUC57-GL為底物，EcoR I/Sal I酶切GL片段，克隆進pUC19的相應(yīng)位點，構(gòu)建pUC19-GL并測序。4．將pUC19-GL用EcoR I/SalI酶切，克隆入pCLON12-IRES-GH中，構(gòu)建pCLON12-GL-IRES-GH并測序。5．質(zhì)粒pCLON12-GL-IRES-GH經(jīng)EcoRI/XhoI雙酶切，回收含有GL-IRES-GH片段，插入pDC315載體的Ec

3、oRI/SalI位點，構(gòu)建為pDC315-GL-IRES-GH即pDC315-G250，質(zhì)粒pDC315-G250帶有CMV啟動子+G250+SV40的表達框，送測序。6．將pDC315-G250與腺病毒包裝骨架質(zhì)粒pBHGE3共轉(zhuǎn)染293細胞，9-12天后出現(xiàn)病毒空斑。病毒小量擴增后提取重組腺病毒的DNA， PCR鑒定正確者即為增殖缺陷型腺病毒AdDC315-G250。
　　 結(jié)果：1.PCR、測序鑒定表明pUC19-GH構(gòu)建

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