分枝菌酸誘導巨噬細胞源性泡沫細胞模型的建立及其對自噬功能的影響.pdf

1、目的:
　　1.建立分枝菌酸誘導巨噬細胞源性泡沫細胞模型，探討分枝菌酸包被聚苯乙烯微球誘導小鼠RAW264.7巨噬細胞泡沫細胞化的條件及特性。
　　2.建立穩(wěn)定表達pEGFP-LC3B的RAW264.7細胞模型。
　　3.探討分枝菌酸所致巨噬細胞泡沫細胞化對細胞自噬功能的影響。
　　方法:
　　1.將RAW264.7細胞分為空白對照組和分別包被0、25、50、75、100μg/mL分枝菌酸的聚苯乙烯微球實驗

2、組，分別將細胞與聚苯乙烯微球混勻，共同孵育24、48、72 h、5d和8d后，油紅O染色，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，采用總膽固醇試劑盒和游離膽固醇試劑盒測定各組泡沫細胞內膽固醇酯的含量，采用MTT法檢測細胞增殖水平。
　　2.以RT-PCR法擴增小鼠LC3B基因，雙酶切后插入真核表達載體pEGFP-C1中，構建pEGFP-LC3B重組質粒。
　　3.經雙酶切及測序鑒定后，將pEGFP-LC3B重組質粒用脂質體2000轉染小鼠巨噬

3、細胞RAW264.7，經G418壓力篩選出穩(wěn)定轉染克隆并將其擴大培養(yǎng)，在熒光顯微鏡下觀察轉染結果。
　　4.將細胞分為三組，分別為空白RAW264.7細胞組、pEGFP-LC3B/RAW264.7細胞組以及用75μg/mL MA誘導5d的pEGFP-LC3B/RAW264.7細胞組。RT-PCR法檢測各組細胞中Becn1及LC3B mRNA轉錄水平，Western-blot法檢測各組細胞中蛋白LC3BⅡ/Ⅰ的比值變化。
　　

4、結果:
　　1.當包被分枝菌酸濃度為75μg/mL、吞噬時間為24h時，RAW264.7能形成典型的泡沫細胞，其細胞內膽固醇酯相對含量為60.98％±1.32％;隨著吞噬時間延長，形成泡沫細胞所需的分枝菌酸的濃度逐漸遞減;且隨著細胞泡沫化程度增加，細胞增殖活力逐漸減弱。
　　2.經雙酶切及測序鑒定，pEGFP-LC3B重組質粒構建成功。
　　3.將pEGFP-LC3B重組質粒轉染RAW264.7細胞，經G418加壓篩選

5、后獲得了表達綠色熒光蛋白的穩(wěn)定轉染株。
　　4.與對照組相比，RAW264.7細胞誘導成為泡沫細胞后其Becn1基因轉錄水平和LC3B表達水平降低，蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ的比值降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論:
　　1.成功構建分枝菌酸誘導巨噬細胞源性泡沫細胞模型。分枝菌酸包被聚苯乙烯微球可快速誘導巨噬細胞形成泡沫細胞，分枝菌酸濃度與細胞泡沫化程度呈正相關，且呈時間依賴性。
　　2.成功構建p