巨噬細(xì)胞Coronin-1參與分枝菌酸誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　研究巨噬細(xì)胞冠蛋白1（Coronin-1）與分枝菌酸（MA）誘導(dǎo)細(xì)胞泡沫化的相關(guān)性及其可能機(jī)制。
　　方法：
　　1.據(jù)Coronin-1表達(dá)水平的差異，實(shí)驗(yàn)分為RAW264.7-Cor.Plus（過(guò)表達(dá)）、RAW264.7（正常表達(dá)）和RAW264.7-Cor.Minus（抑制表達(dá)）三組。三組細(xì)胞分別用（0、25、50、75、100）μg/mL MA包被的聚苯乙烯微球作為吞噬顆粒，分別吞噬24、48、72

2、 h，5、8 d；細(xì)胞通過(guò)油紅O染色后，直接觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴堆積情況，并用總膽固醇（TC）酶法測(cè)定試劑盒、游離膽固醇（FC）酶法測(cè)定試劑盒分別檢測(cè)各組細(xì)胞TC、FC，再通過(guò)膽固醇酯（CE）和CE/TC比值定量評(píng)估巨噬細(xì)胞泡沫化水平。
　　2.各組細(xì)胞經(jīng)100μg/mL MA包被的聚苯乙烯微球作用24h后提取總蛋白，用RT-PCR、Western-blot法檢測(cè)細(xì)胞Coronin-1的表達(dá)水平。
　　3.三組細(xì)胞經(jīng)2μmol/L

3、松胞菌素D（ctyD）處理后，分別用（0、25、50、75、100）μg/mL MA包被的聚苯乙烯微球作為吞噬顆粒，分別吞噬24、48、72 h，5、8 d，再次測(cè)定其細(xì)胞泡沫化水平。
　　4.將ctyD處理細(xì)胞（RAW264.7-ctyD、RAW264.7-ctyD-MA）及其對(duì)照組分別用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽（FITC-phalloidin）染色，計(jì)算纖維型肌動(dòng)蛋白（F-actin）重排率。
　　5.三組細(xì)胞分別經(jīng)

4、（0、25、50、75、100）μg/mL MA包被的聚苯乙烯微球作用24、48、72 h，5、8 d，通過(guò)定磷法測(cè)定鈣調(diào)磷酸酶活性，并用Western-blot法測(cè)定實(shí)驗(yàn)組（100μg/mL MA，作用24h）及其對(duì)照組細(xì)胞的鈣調(diào)磷酸酶表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.受不同包被濃度的MA誘導(dǎo)后，表達(dá)不同水平Coronin-1的各組細(xì)胞的泡沫化水平與MA包被劑量和MA作用時(shí)間呈正比；Coronin-1表達(dá)量最高的RAW264

5、.7-Cor.Plus細(xì)胞泡沫化水平最高，Coronin-1表達(dá)量最低的RAW264.7-Cor.Minus細(xì)胞泡沫化水平最低，其泡沫化水平呈現(xiàn)的趨勢(shì)為：RAW264.7-Cor.Plus＞RAW264.7＞RAW264.7-Cor.Minus。
　　2.各組細(xì)胞受MA誘導(dǎo)后，其Coronin-1的表達(dá)量顯著高于相應(yīng)對(duì)照組，其表達(dá)量從高至低依次為RAW264.7-Cor.Plus、RAW264.7、RAW264.7-Cor.Min

6、us。
　　3.ctyD處理組細(xì)胞與相應(yīng)的未處理組相比，ctyD處理組細(xì)胞泡沫化水平顯著低于其未處理對(duì)照組。但是, ctyD處理組細(xì)胞泡沫化水平呈現(xiàn)的趨勢(shì)仍然為：RAW264.7-Cor.Plus＞RAW264.7＞RAW264.7-Cor. Minus。ctyD抑制巨噬細(xì)胞F-actin顯著降低了MA誘導(dǎo)的泡沫化水平，但抑制F-actin對(duì)Coronin-1與MA誘導(dǎo)細(xì)胞泡沫化的正相關(guān)性并無(wú)顯著影響。
　　4.經(jīng)熒光素標(biāo)記

7、的鬼筆環(huán)肽染色后，MA誘導(dǎo)組細(xì)胞的F-actin重排率顯著高于非MA誘導(dǎo)的對(duì)照組細(xì)胞。
　　5.三組細(xì)胞經(jīng)不同包被濃度MA微球誘導(dǎo)不同時(shí)間后，在相同MA包被濃度和相同作用時(shí)間下，其鈣調(diào)磷酸酶活性從高至低依次為：RAW264.7-Cor.Plus＞RAW264.7＞RAW264.7-Cor.Minus，但是，如果MA作用時(shí)間為5~8d，三組細(xì)胞鈣調(diào)磷酸酶活性穩(wěn)定在一個(gè)較低水平，差異無(wú)顯著性；三組細(xì)胞經(jīng)100μg/mL包被濃度的MA微