維生素D誘導(dǎo)自噬對(duì)巨噬細(xì)胞清除結(jié)核分枝桿菌的作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：機(jī)體內(nèi)巨噬細(xì)胞(macrophage， Mφ)與結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis， Mtb)的相互作用影響著結(jié)核病（tuberculosis，TB）的發(fā)展方向，增強(qiáng)Mφ對(duì)胞內(nèi)Mtb的殺滅能力成為治療 TB和減少發(fā)病的重要策略。維生素D通過與維生素D受體（Vitamin Dreceptor，VDR）的結(jié)合，對(duì)誘導(dǎo)Mφ自噬以及自噬溶酶體的成熟發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。本課題旨在研究維生素D誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生自

2、噬并清除巨噬細(xì)胞內(nèi)Mtb的作用。
　　方法：(1)建立Mφ感染Mtb的體外模型：使用豆蔻酰佛波醇乙酯(phorbol12-myristate13-acetate，PMA)誘導(dǎo)人單核巨噬細(xì)胞系U937分化，使之具有吞噬能力，分化后的 U937細(xì)胞經(jīng) Mtb標(biāo)準(zhǔn)人型毒力株H37Rv處理，建立 Mφ感染 Mtb的體外模型。(2)實(shí)驗(yàn)分組：分化的U937細(xì)胞隨機(jī)分為：陰性對(duì)照組（RPMI1640培養(yǎng)基，24小時(shí)）、維生素D組[100pM1

3、,25（OH）2D3，24小時(shí)]、自噬抑制劑+維生素D組[10μM3-甲基腺嘌呤（3-methyl adenine，3-MA）+100pM1,25（OH）2D3，24小時(shí)]、陽性對(duì)照組（10nM雷帕霉素，18小時(shí)），各組細(xì)胞以H37Rv感染（細(xì)菌：細(xì)胞=10：1）4小時(shí)。（3）檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)：感染后第4天，利用臺(tái)盼藍(lán)染料排斥試驗(yàn)評(píng)價(jià)藥物的細(xì)胞毒性。半定量RT-PCR檢測(cè)自噬相關(guān)基因（autophagy-related genes，Atg）

4、Atg5、Beclin-1及人抗菌肽LL-37、微管相關(guān)蛋白輕鏈3（microtubule-associated protein1 light chain3，LC3）B mRNA的表達(dá)。Western Blotting檢測(cè)LL-37、LC3B-Ⅱ蛋白的表達(dá)。分別計(jì)數(shù)感染后第1、4天細(xì)胞內(nèi)Mtb的菌落形成單位(colony forming units， cfu)。流式細(xì)胞術(shù)計(jì)數(shù)感染后第4天LC3B-Ⅱ+和/或結(jié)核分枝桿菌抗原85A+（Ag

5、85A+）的細(xì)胞數(shù)。
　　結(jié)果：(1)實(shí)驗(yàn)中臺(tái)盼藍(lán)染料排斥試驗(yàn)顯示細(xì)胞存活率均達(dá)96％以上；(2)與對(duì)照組相比，半定量 RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)維生素 D組 Atg5、Beclin-1、LL-37、LC3B mRNA的表達(dá)增強(qiáng)（ P＜0.01）；(3)Western Blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)維生素 D組 LL-37蛋白的表達(dá)增加（P＜0.01）及LC3B-Ⅱ蛋白的表達(dá)增加（P＜0.05）；(4)感染后第1天維生素 D組細(xì)胞內(nèi)Mtb的菌

6、落數(shù)無明顯改變（P＞0.05），而感染后第4天維生素D組細(xì)胞內(nèi) Mtb的菌落數(shù)顯著減少（P＜0.01）；(5)與陰性對(duì)照組比較，流式細(xì)胞術(shù)顯示維生素D組LC3B-Ⅱ+-細(xì)胞增多，Ag85A+-細(xì)胞減少，且 LC3B-Ⅱ+-Ag85A--細(xì)胞增加（維生素 D組65.1%比陰性對(duì)照組2.22%）；(6)與維生素D組相比，在自噬抑制劑3-MA+維生素D組中，不但Atg5、Beclin-1、LC3B的mRNA表達(dá)受到抑制，LL-37的mRNA表