甜高梁再生體系的優(yōu)化研究.pdf

1、甜高粱的光合效率是小麥等作物的2～3倍,是目前公認(rèn)的最具優(yōu)勢(shì)的生物質(zhì)能源作物,可糖、糧兼用,其綜合價(jià)值高。然而截止目前,甜高粱缺少綜合性狀優(yōu)良的品種。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù),對(duì)現(xiàn)有的甜高梁品種進(jìn)行定向改良,有望獲得高生物量和高抗逆性的新品種。甜高粱再生體系的穩(wěn)定、高效性在其遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)起到關(guān)鍵作用。
　　 本研究以引種至廣西南寧種植的北甜三號(hào)(BT3)和遼甜三號(hào)(LT3)兩個(gè)甜高粱品種的成熟種子為試驗(yàn)材料,主要優(yōu)化這兩個(gè)品種的再生體系,以

2、期獲得方便、高效、穩(wěn)定的甜高粱再生體系,為下一步遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立奠定良好的基礎(chǔ)。
　　 目前取得的主要研究結(jié)果如下:
　　 1優(yōu)化愈傷組織的誘導(dǎo)
　　 首先通過不同植物激素2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、1-萘乙酸(NAA)、6-芐基腺嘌呤(6-BA)、激動(dòng)素(KT)濃度配比的優(yōu)化試驗(yàn),得出最優(yōu)激素組合:BT3為2.0mg/L2,4-D+0.1mg/LNAA,LT3為2.0mg/L2,4-D+0.2mg/L

3、NAA。在上一步的基礎(chǔ)上,再通過不同基本培養(yǎng)基(MS、1/2MS、B5、N6)、不同糖源(蔗糖、葡萄糖、葡萄糖:果糖=3:2)、不同pH值(5.3、5.8、6.3)的優(yōu)化試驗(yàn),另外還通過不同濃度硝酸銀(AgNO3)(四個(gè)水平:2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響試驗(yàn),最終篩選出兩品種的最佳愈傷組織誘導(dǎo)配方:BT3為MS+2.0mg/L2,4-D+0.1mg/LNAA,LT3為MS+2.0mg/L2,4-D

4、+0.2mg/LNAA,pH值5.8、蔗糖為糖源時(shí),胚性出愈率最高,愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加AgNO3不能促進(jìn)兩基因型甜高粱種子愈傷組織的形成,相反卻降低了其胚性愈傷組織的誘導(dǎo)。另外,通過愈傷組織的不斷繼代培養(yǎng)觀察,摸索出最適的愈傷組織增殖配方:MS+2.0mg/L2,4-D+0.5～1.0mg/LNAA,兩品種的愈傷組織在此配方上不僅褐化率低,而且增殖快。
　　 2潮霉素對(duì)甜高粱愈傷組織生長(zhǎng)的影響
　　 通過在愈傷組織

5、增殖培養(yǎng)基中添加不同濃度(四個(gè)濃度梯度:25、50、75和100mg/L)的潮霉素試驗(yàn),可觀察比較得出,75和100mg/L潮霉素處理使BT3和LX3的胚性愈傷組織全部死亡并變?yōu)楹诤稚?。采用這兩個(gè)濃度潮霉素篩選甜高粱的抗性愈傷組織,將可能會(huì)影響轉(zhuǎn)化細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。潮霉素水平為25mg/L時(shí)不可以完全地抑制甜高粱胚性愈傷的生長(zhǎng),若用其篩選轉(zhuǎn)化成功的愈傷組織,將不能使許多非轉(zhuǎn)化的愈傷組織死亡。然而當(dāng)潮霉素的濃度水平為50mg/L時(shí),甜高粱的

6、胚性愈傷可以完全停止生長(zhǎng)并最終褐化死亡,但細(xì)胞不會(huì)大量地快速死亡,因此可以作為BT3和LT3兩品種轉(zhuǎn)化細(xì)胞篩選的理想濃度。
　　 另外,25和50mg/L潮霉素對(duì)兩品種愈傷組織生長(zhǎng)影響的結(jié)果為L(zhǎng)T3愈傷組織存活率都高于BT3,這說明潮霉素對(duì)甜高粱愈傷組織的影響存在基因型差異。
　　 3叢生芽誘導(dǎo)的優(yōu)化
　　 通過不同植物激素(6-BA、NAA、2,4-D)濃度配比的優(yōu)化試驗(yàn),可比較得出兩甜高梁品種叢生芽誘導(dǎo)的最佳

7、激素配比都為MS+1.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+0.5mg/L,2,4-D,但是它們的叢生芽誘導(dǎo)率有一定程度的差異。另外,通過多次試驗(yàn)觀察對(duì)比,摸索出適宜兩品種的叢生芽增殖配方:MS+1.0mg/LNAA+1.0mg/L6-BA,壯苗配方:MS+0.1mg/LNAA+1.0mg/L6-BA。
　　 4甜高粱組培苗生根的優(yōu)化
　　 首先通過不同基本培養(yǎng)基(MS、1/2MS)對(duì)組培苗生根的影響試驗(yàn),可比較得出