平邑甜茶MhCDPK基因克隆、表達(dá)、載體構(gòu)建及其再生體系的建立.pdf

1、鈣依賴蛋白激酶(CDPKs)是一種鈣依賴的Ser/Thr型蛋白激酶，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境信號(hào)傳遞中起重要作用；平邑甜茶(Malus hupehensis(Pamp)Rehd.vat pinyiensis Jiang，PYTC)是優(yōu)良的蘋(píng)果砧木。本文從平邑甜茶葉片中克隆了MhCDPK全長(zhǎng)，分析了其序列與編碼蛋白，研究了脅迫下MhCDPK表達(dá)，并成功地建立了平邑甜茶再生體系，主要結(jié)果如下： 1.根據(jù)已知植物CDPK基因序列設(shè)計(jì)引物，

2、利用RT-PCR獲得了平邑甜茶CDPK基因，命名為MhCDPK。GenBank注冊(cè)號(hào)為EF519915。序列分析表明，MhCDPK cDNA全長(zhǎng)1999bp，編碼區(qū)長(zhǎng)1701bp，編碼566個(gè)氨基酸，分子量和等電點(diǎn)分別為62.9kD和5.26。MhCDPK編碼的蛋白具有典型的CDPK結(jié)構(gòu)特征，包括N端可變區(qū)(1-108)、激酶區(qū)(109-366)、連接區(qū)(367-402)和調(diào)節(jié)區(qū)(403-566)。推測(cè)的MhCDPK氨基酸序列與植物中的

3、許多CDPKs具有很高的同源性。 2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR表明，NaCl、干旱以及重金屬等脅迫均能提高M(jìn)hCDPK基因表達(dá)量。 3.構(gòu)建了MhCDPK正義與反義表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LB4404，對(duì)煙草葉片進(jìn)行侵染，獲得了轉(zhuǎn)反義基因煙草植株。構(gòu)建了pBI121-gMhCDPK-GFP表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，侵染洋蔥表皮使其表達(dá)，在熒光顯微鏡下觀察，MhCDPK定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。 4.幼苗莖段為離體培養(yǎng)合適的外

4、植體；在培養(yǎng)基MS+0.5mg·L-1BA+0.2mg·L-1ZT+0.1mg·L-1NAA中增殖倍數(shù)達(dá)15.6倍；培養(yǎng)基1/2MS+IBA0.5mg·L-1+NAA0.3 mg·L-1中生根率達(dá)85.6％，生根條數(shù)達(dá)15.5條。 5.6-BA、ZT、NAA和暗培養(yǎng)均有利于葉片不定芽的分化；以MS+6.0mg·L-1 BA+0.5mgL-1NAA+0.2 mg·L-1ZT+6.0 mg·L-1 SNP為培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)15d，葉片