毛竹再生體系構(gòu)建的初步研究.pdf

1、毛竹是我國(guó)竹子中最重要的竹種，栽培面積最大和經(jīng)濟(jì)效益最好，但其生物學(xué)特性導(dǎo)致種質(zhì)資源創(chuàng)新困難。近年來隨著竹產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展和轉(zhuǎn)基因技術(shù)日益成熟，適合毛竹工業(yè)化利用的無性系創(chuàng)制在技術(shù)上和產(chǎn)業(yè)化上成為可能，穩(wěn)定的再生體系構(gòu)建是毛竹轉(zhuǎn)基因育種不可缺少的技術(shù)平臺(tái)。本研究通過對(duì)竹筍、種胚等外植體材料進(jìn)行了種胚消毒、愈傷組織誘導(dǎo)、增殖、分化及懸浮培養(yǎng)、細(xì)胞學(xué)觀察等研究，結(jié)論如下：
　　1.毛竹鞭筍、冬筍、春筍等外植體消毒較容易，選擇籜包裹緊實(shí)的筍

2、體，經(jīng)過75％乙醇消毒后在超凈臺(tái)下剝?nèi)o菌部分就可以獲得滿意的無菌得率，無菌得率高達(dá)95%以上，偶有個(gè)別細(xì)菌污染。
　　種胚消毒較困難，次氯酸鈣類消毒劑對(duì)種子活力影響明顯，抗生素消毒效果差不能殺死種子上的微生物，過氧化氫也不適合種胚消毒，以0.1%升汞消毒效果最好。毛竹種胚最佳的消毒處理為：種胚預(yù)處理，去掉尾部容易污染部分，浸種12h后，采取0.1%升汞消毒20min，無菌水漂洗10遍。這樣可以獲得較為滿意的消毒效果，污染基本為一

3、種單一真菌污染，極少有細(xì)菌和其他雜菌污染，可能是附著在種胚表面的優(yōu)勢(shì)真菌導(dǎo)致消毒困難。
　　隔年陳種子因生活力顯著下降一般不宜作為外植體，種子采集時(shí)間早種胚尚未發(fā)育完全，污染率低同時(shí)種胚發(fā)芽率也低。不同溫度的熱處理對(duì)種子活力影響很大，種子幾乎全部喪失生活力，同時(shí)對(duì)改善嚴(yán)重污染沒有幫助作用。
　　2.毛竹筍（鞭筍、冬筍、春筍等）及筍籜外植體誘導(dǎo)愈傷組織較易，誘導(dǎo)率高達(dá)100%，但質(zhì)量不高，沒有獲得緊實(shí)的胚性愈傷組織，愈傷組織水

4、漬化嚴(yán)重，繼代培養(yǎng)時(shí)嚴(yán)重褐變，各種措施均無法挽救，細(xì)胞學(xué)檢查表明多數(shù)細(xì)胞缺失細(xì)胞核。放置方式和切割方式對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)沒有影響，接觸培養(yǎng)基部分容易產(chǎn)生愈傷組織；在誘導(dǎo)速度上春筍較快，鞭筍次之，冬筍反應(yīng)相對(duì)較慢。
　　毛竹種胚誘導(dǎo)的愈傷組織可以分為兩種類型，一類是緊實(shí)的胚性愈傷組織，一類是疏松的非胚性愈傷組織。切割方式對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響明顯，橫切方式由于切除了種胚的胚根組織，對(duì)控制胚根部位產(chǎn)生疏松易褐變愈傷組織有幫助，更容易產(chǎn)生胚性

5、愈傷組織；在兩種放置方式中，盾片朝下接觸培養(yǎng)基能夠獲得較高的愈傷組織誘導(dǎo)率。胚性愈傷組織一般產(chǎn)生在根莖結(jié)合部位或者盾片部位，顏色淡黃色，用鑷子夾取時(shí)感覺緊實(shí)；非胚性愈傷組織一般源自根部，顏色發(fā)白或紫褐色，松軟，用鑷子夾取易碎，水漬狀明顯。
　　3.毛竹筍（包括春筍、冬筍、鞭筍及其筍籜）誘導(dǎo)的愈傷組織分化培養(yǎng)中容易褐變，在各種條件下均沒有出現(xiàn)分化跡象，其增殖培養(yǎng)也不成功。
　　在種胚誘導(dǎo)的愈傷組織中，因含有胚性愈傷組織，尚有個(gè)

6、別出現(xiàn)分化跡象，但沒有獲得再生植株，增殖培養(yǎng)中，除個(gè)別非胚性愈傷組織能夠?qū)崿F(xiàn)正常增殖外，胚性愈傷組織存在褐變嚴(yán)重，生長(zhǎng)速度慢，對(duì)各種培養(yǎng)條件調(diào)整不敏感，無論轉(zhuǎn)接與否，胚性愈傷組織都不可逆朝著死亡褐變方向發(fā)展。
　　按照存活數(shù)統(tǒng)計(jì)，脯氨酸、谷氨酰胺、水解酪蛋白、椰乳等有機(jī)添加物可以提高存活數(shù)，但酵母效果不明顯，筍汁添加反而使存活數(shù)下降；糖的種類對(duì)愈傷組織影響不是很大，除甘露糖之外，葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖對(duì)愈傷組織存活影響相

7、差無幾。培養(yǎng)基中除N6培養(yǎng)基效果較差外，MS、CC、WC、NB、KM8P等培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織繼代培養(yǎng)影響效果相當(dāng)。
　　4.毛竹非胚性愈傷組織的懸浮培養(yǎng)結(jié)果表明，培養(yǎng)基中2,4-D濃度變化對(duì)愈傷組織增殖影響不是很大，愈傷組織在懸浮培養(yǎng)液中需要長(zhǎng)達(dá)12d增殖速度才變快，接種量雖能使愈傷組織增殖提前，但效果不明顯，研究發(fā)現(xiàn)毛竹非胚性愈傷組織對(duì)外界條件反應(yīng)不敏感且在懸浮培養(yǎng)條件下增殖速度慢。
　　5.細(xì)胞學(xué)觀察結(jié)果表明，在毛竹幾種不