酶法再生輔酶NAD(P)H循環(huán)體系的構(gòu)建及其應(yīng)用初步研究.pdf

1、氧化還原酶廣泛應(yīng)用于催化制備手性醇、羥基酸、氨基酸等方面。大多數(shù)的氧化還原酶催化反應(yīng)都需要輔酶，在其所需輔酶中，NAD(P)+-NAD(P)H體系占90％左右。但這些輔酶價(jià)格昂貴，限制了氧化還原酶的應(yīng)用。采用基因工程技術(shù)對(duì)酶法再生輔酶中的關(guān)鍵酶進(jìn)行克隆和高表達(dá)是解決氧化還原酶輔酶再生的關(guān)鍵。赭色擲孢酵母中乙醛還原酶可以催化4-氯-乙酰乙酸乙酯(COBE)為(R)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯(R-CHBE)，該不對(duì)稱還原反應(yīng)需要還原性輔酶N

2、ADPH參與，因此R-CHBE的高效制備需要輔酶再生循環(huán)的耦合。
　　 本論文的主要內(nèi)容包括：①高效表達(dá)甲酸脫氫酶構(gòu)建輔酶NADH再生體系；②高效表達(dá)葡萄糖脫氫酶構(gòu)建輔酶NADPFH再生體系；③乙醛還原酶的克隆和表達(dá)；④乙醛還原酶與輔酶再生體系偶聯(lián)轉(zhuǎn)化4-氯-乙酰乙酸乙酯。
　　 本論文首先構(gòu)建了高效的輔酶NADH再生系統(tǒng)：根據(jù)甲酸脫氫酶基因序列，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增甲酸脫氫酶基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-fdh轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌進(jìn)

3、行表達(dá)，經(jīng)過宿主和載體、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度等參數(shù)優(yōu)化，重組菌中甲酸脫氫酶比酶活達(dá)到0.409U/mg蛋白，重組蛋白表達(dá)量約占全菌可溶性蛋白的17％，得到了高效表達(dá)甲酸脫氫酶的重組菌Rosetta/pET-fdh。
　　 本論文構(gòu)建了高效的輔酶NADPH再生系統(tǒng)：根據(jù)葡萄糖脫氫酶基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增葡萄糖脫氫酶基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-gdh并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)。重組菌葡萄糖脫氫酶比酶活高達(dá)9.65U/mg蛋白，重組蛋白表達(dá)

4、量占全菌可溶性蛋白的53％。獲得了高產(chǎn)葡萄糖脫氫酶的基因工程菌株。
　　 本論文實(shí)現(xiàn)了乙醛還原酶在大腸桿菌中的高效表達(dá)，并研究了乙醛還原酶與輔酶再生體系耦合催化不對(duì)稱還原反應(yīng)：通過RT-PCR從真核生物赭色擲孢酵母中克隆了乙醛還原酶cDNA序列，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET-alr，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中。重組菌經(jīng)誘導(dǎo)后乙醛還原酶比酶活達(dá)到4.091U/mg蛋白，顯著高于原始菌株赭色擲孢酵母。以重組菌BL21/pET-alr和BL

5、21/pET-gdh雙菌混合選擇性還原COBE，產(chǎn)物CHBE的轉(zhuǎn)化率在7h時(shí)達(dá)到85.19％，22h后達(dá)到95.88％，產(chǎn)物R-CHBE的光學(xué)純度為92％。雙菌雙酶的COBE轉(zhuǎn)化率和轉(zhuǎn)化速率均顯著優(yōu)于BL21/pET-alr的單菌轉(zhuǎn)化。該雙菌雙酶轉(zhuǎn)化體系無需添加輔酶，實(shí)現(xiàn)了高效的輔酶再生與耦合還原催化。
　　 本論文高效表達(dá)了甲酸脫氫酶和葡萄糖脫氫酶，構(gòu)建了良好的輔酶再生體系，并將葡萄糖脫氫酶和乙醛還原酶偶聯(lián)，大幅度提高了輔酶循