NAD(P)H氧化酶在膠質(zhì)瘤的表達(dá)及與其惡性程序相關(guān)性研究.pdf

1、背景:近年來，顱內(nèi)腫瘤發(fā)病率呈上升趨勢，據(jù)統(tǒng)計，顱內(nèi)腫瘤約占全身腫瘤的5％，占兒童腫瘤的70％，最常見的腦瘤是腦膠質(zhì)瘤(glioma)。腦膠質(zhì)瘤約占顱內(nèi)腫瘤的40％-45％，來源于各型膠質(zhì)細(xì)胞。而廣義上，腦膠質(zhì)瘤應(yīng)包括整個神經(jīng)上皮組織來源的各型膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的腫瘤包括髓上皮瘤、髓母細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、少枝膠質(zhì)瘤、室管膜瘤等;按腫瘤惡性程度可以將膠質(zhì)瘤分成(Ⅰ-Ⅳ)四級。
　　 臨床上腦膠質(zhì)瘤臨床表現(xiàn)主要包括顱內(nèi)高

2、壓癥狀和病變局部癥狀。膠質(zhì)瘤引起顱內(nèi)壓增高的機(jī)制有:腫瘤實(shí)質(zhì)占位;腫瘤周圍水腫;腫瘤囊變或出血;腫瘤顱高壓癥狀出現(xiàn)的早晚、發(fā)展的快慢、以及輕重，取決于腫瘤的生長速度、位于腦脊液通路周圍或回流靜脈旁或顱后窩等情形。膠質(zhì)瘤的臨床表現(xiàn)是重要的鑒別依據(jù)，此外神經(jīng)影像學(xué)依據(jù)有包括病變所在部位，病變信號，病變內(nèi)部質(zhì)地，周邊形態(tài)，強(qiáng)化情況，周圍腦結(jié)構(gòu)等情況對確定病變性質(zhì)和范圍，制定治療方案具有重要意義。
　　 關(guān)于腦膠質(zhì)瘤的治療，首先是手術(shù)治

3、療，對于原發(fā)性腫瘤，予以外科手術(shù)切除，盡可能將腫瘤細(xì)胞移除干凈，避免細(xì)胞增生仍是最普遍的治療模式。對于良性腫瘤，采用手術(shù)完全切除的機(jī)率較高，病人的存活率也較高。但是對于惡性程度較高的特別是WHO分級Ⅲ級以上的腫瘤，鑒于膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性生長以及異常的生物學(xué)特性，對放化療的不敏感，治療效果不佳;而且經(jīng)常以同級別或高級別復(fù)發(fā)，增加了病人的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此通過臨床實(shí)驗(yàn)和基礎(chǔ)研究分析膠質(zhì)瘤惡性表型對于治療具有重要意義。
　　 腫瘤發(fā)生

4、是多種因素引起。有實(shí)驗(yàn)證明，應(yīng)用自由基清除劑和抗氧化劑在整體或體外實(shí)驗(yàn)中都有抑制某些致癌作用。這提示體內(nèi)過多的自由基可能通過某些機(jī)制引起組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能改變，生長水平上失去了控制，由此引起和促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展和惡化?；钚匝?ReactiveOxygenSpecies，ROS)是指化學(xué)性質(zhì)活躍的含氧原子或原子團(tuán)，包括超氧陰離子自由基、過氧化氫(H2O2)、脂過氧化自由基等。細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生的酶體主要有NADPH氧化酶(Nicotinam

5、idevadeninedinucleotidephosphateoxidase，NOX)、黃瞟嶺氧化酶等，其中NOX是細(xì)胞中ROS的主要來源。ROS被認(rèn)為是細(xì)胞代謝的有毒副產(chǎn)物，可以直接與脂質(zhì)、蛋白、DNA等分子相互作用，導(dǎo)致組織學(xué)改變和功能異常。目前越來越多的研究表明，ROS在低濃度可作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，參與機(jī)體多種細(xì)胞病理生理反應(yīng)過程。研究顯示在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化過程中，細(xì)胞內(nèi)ROS也明顯增加，提示ROS在上述病理生理反應(yīng)中可能起了

6、重要作用。研究認(rèn)為，ROS可以活化蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子和基因表達(dá)等。NADPH氧化酶是細(xì)胞內(nèi)ROS的重要來源。通常情況下，該酶處于靜息狀態(tài)，在受到適當(dāng)?shù)拇碳杆倩罨?。NADPH氧化酶可以和細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、脂類和糖類等相互作用，造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能改變，由此引起和促進(jìn)腫瘤特別是膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展。
　　 基于上述研究背景，結(jié)合膠質(zhì)瘤在臨床診斷和治療中所遇到的一些問題，本題通過收集臨床不同級別的膠質(zhì)瘤病例和標(biāo)本檢測NAD(P)H氧

7、化酶在不同惡性程度膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及ROS的含量，探討NAD(P)H氧化酶及細(xì)胞內(nèi)ROS對對膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展的影響及其與膠質(zhì)瘤惡性程度的相關(guān)性，以期進(jìn)一步用于指導(dǎo)臨床膠質(zhì)瘤的診斷和治療。
　　 目的:檢測NAD(P)H氧化酶及ROS在不同惡性程度膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，探討NAD(P)H氧化酶及細(xì)胞內(nèi)ROS對膠質(zhì)瘤發(fā)生增值及其與膠質(zhì)瘤惡性程度的相關(guān)性。為膠質(zhì)瘤患者的診斷和治療的臨床和基礎(chǔ)研究提供了新的思路。
　　 方法:收集200

8、7年8月2010年8月珠江醫(yī)院神經(jīng)外科膠收治的不同級別的30膠質(zhì)瘤病人組織標(biāo)本，參照WHO公布的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類和惡性程度分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷和分級，以及10例對照組病人組織標(biāo)本，病人年齡3～68歲，平均年齡38.5±14.8歲，收集上述腫瘤組織標(biāo)本以及10例對照組病人組織標(biāo)本，分為正常腦組織對照組(10例)、低級別膠質(zhì)瘤(ⅠⅡ級共10例)、Ⅲ級膠質(zhì)瘤(10例)和Ⅳ級膠質(zhì)瘤(10例)。30例病例資料中男性18例，女性12例，各組病人性別

9、、年齡等資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，遵循均衡和隨機(jī)原則。通過:
　　 1.RealtimePCR的方法檢測組織(細(xì)胞)中NOX基因的表達(dá)量;
　　 2.carboxy-H2DCFDA測定組織ROS的含量;
　　 3.Westernblot和免疫熒光檢測組織中NOX的表達(dá)水平;
　　 4.結(jié)合合理的統(tǒng)計學(xué)分析方法;
　　 分析檢測NAD(P)H氧化酶及ROS在不同惡性程度膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，探討NAD(P

10、)H氧化酶及細(xì)胞內(nèi)ROS與膠質(zhì)瘤惡性程度的相關(guān)性。
　　 結(jié)果:
　　 1.RealtimePCR檢測膠質(zhì)瘤組織細(xì)胞中NOXmRNA的表達(dá)水平
　　 本研究中40例標(biāo)本分為正常對照組、低級別膠質(zhì)瘤(ⅠⅡ級)、Ⅲ級膠質(zhì)瘤和Ⅳ級膠質(zhì)瘤，引入Taqman熒光探針，用realtimePCR的方法分析各組NOXmRNA的表達(dá)，選擇人GAPDH基因作為內(nèi)參，結(jié)果提示40例標(biāo)本均能檢測到NOXl-5mRNA有一定程度的表達(dá)，與

11、對照組差別有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.001，但是，各組之間兩兩比較時，尤以NOX4在各實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.001，提示正常對照組、低級別膠質(zhì)瘤(ⅠⅡ級)、Ⅲ級膠質(zhì)瘤和Ⅳ級膠質(zhì)瘤隨著腫瘤分級的遞增，而NOX1、2、3、5的表達(dá)在不同惡性程度的腫瘤組織中的表達(dá)差異兩兩比較差別不具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05。
　　 2.Carboxy-H2DCFDA測定組織ROS的產(chǎn)生
　　 膠質(zhì)瘤組織加經(jīng)過制備細(xì)胞懸液，并加入

12、含有最終濃度為10uM的carboxy-H2DCFDA的的溶液，用流式細(xì)胞儀檢測組織中ROS的含量，結(jié)果顯示，從正常對照組、低級別膠質(zhì)瘤(ⅠⅡ級)、Ⅲ級膠質(zhì)瘤和Ⅳ級膠質(zhì)瘤隨著腫瘤分級的遞增，組織中ROS的含量的熒光強(qiáng)度隨著遞增，膠質(zhì)瘤組織中ROS的生產(chǎn)水平增高。各腫瘤組與對照組相比差別具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.001，提示膠質(zhì)瘤腫瘤較正常對照組ROS含量增高，不同級別之間腫瘤組織的ROS的含量差別亦具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.001，提示RO

13、S含量與腫瘤的惡性程度正相關(guān)。
　　 3.Westernblot檢測NOX的表達(dá)
　　 正常對照組和各級膠質(zhì)瘤組織WesternBlot結(jié)果顯示，NOX蛋白在正常對照組標(biāo)本中呈低表達(dá)或陰性，而在低級別膠質(zhì)瘤(ⅠⅡ級)表達(dá)量增加，并且隨著腫瘤組織的惡性程度的遞增，如Ⅲ級膠質(zhì)瘤和Ⅳ級膠質(zhì)瘤NOX表達(dá)遞增，與對照組相比差別具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.001。這與通過熒光定量RT-PCR檢測膠質(zhì)瘤組織細(xì)胞中NOXmRNA的表達(dá)水平的

14、趨勢一致。NOX蛋白在不同級別膠質(zhì)瘤中表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示該蛋白可能通過某些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與了腫瘤的惡性進(jìn)展。
　　 4.免疫熒光檢測NOX的表達(dá)分布
　　 經(jīng)過免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，NOX蛋白在正常對照組標(biāo)本中呈低表達(dá)甚至不表達(dá)，但是在低級別膠質(zhì)瘤(ⅠⅡ級)、Ⅲ級膠質(zhì)瘤和Ⅳ級膠質(zhì)瘤組都看到有熒光結(jié)顯示，這提示在這些組織中有NOX蛋白，并且隨著惡性程度的增加，表達(dá)量相應(yīng)增加，惡性程度越高，NOX表達(dá)水平越高。

15、r>　　 結(jié)論:對比正常對照組，惡性程度越高的膠質(zhì)瘤NOX基因的表達(dá)水平增高，其中NOX4在不同惡性程度的膠質(zhì)瘤的表達(dá)水平差異統(tǒng)計學(xué)意義;對比正常對照組，惡性程度越高的膠質(zhì)瘤組織生成的ROS也增多。膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本的中NOX基因的表達(dá)量以及ROS的含量與其惡性程度呈正相關(guān)。NOX4可能是膠質(zhì)瘤組織中生產(chǎn)ROS的主要酶體，并且NOX4氧化酶及其生產(chǎn)的ROS可能對膠質(zhì)瘤的存活和惡性增殖有著重要的調(diào)節(jié)作用，而且與膠質(zhì)瘤的惡性程度密切相關(guān)。這一