擬南芥線粒體中交替型NAD(P)H脫氫酶活性復(fù)合體的蛋白質(zhì)相互作用研究.pdf

1、細(xì)胞是生命的基本單位，而線粒體是細(xì)胞的重要的產(chǎn)能單位，它通過(guò)氧化磷酸化合成ATP，為細(xì)胞生命活動(dòng)提供能量。植物線粒體中具有多種交替途徑所介導(dǎo)的能量耗散系統(tǒng)，主要包括末端交替氧化途徑，解偶聯(lián)途徑和交替型NAD(P)H脫氫途徑。交替型NAD(P)H脫氡途徑由一類交替型NAD(P)H脫氧酶催化，能夠催化電子沿電子傳遞鏈傳遞給O2，但是不伴隨質(zhì)子跨膜梯度形成和ATP產(chǎn)生，因其不能被魚(yú)藤酮所抑制，又被稱為魚(yú)藤酮非敏感性NAD(P)H脫氫酶。近年來(lái)

2、在分離交替型NAD(P)H脫氫酶方面取得了很多進(jìn)展。對(duì)于蛋白質(zhì)的研究近年宋又成為焦點(diǎn)，在蛋白質(zhì)復(fù)合體水平上的研究，不僅可以揭示未知功能蛋白的功能，還可以在探索己知蛋白在不同復(fù)合體中的新的功能。本論文以模式植物擬南芥為研究對(duì)象，從擬南芥線粒體可溶性部分中分離到一種具有類似于交替型NAD(P)H脫氫酶活性的復(fù)合體。通過(guò)質(zhì)譜鑒定和蛋白質(zhì)復(fù)合體研究手段確定了該復(fù)合體中蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用。取得了以下研究結(jié)果：
　　 1.利用Nativ

3、e-PAGE從擬南芥線粒體可溶性部分中分離得到一個(gè)具有交替型NAD(P)H脫氫酶活性的復(fù)合體。利用MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)，在這個(gè)復(fù)合體中除了硫辛酰胺脫氫酶LPD2以外，還存在兩個(gè)主要的亞基，N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸還原酶NAGPR和分子伴侶Cpn20，為擬南芥交替型NAD(P)H脫氫酶的研究作出了補(bǔ)充。
　　 2.利用免疫共沉淀技術(shù)(co-IP)研究擬南芥NAD(P)H脫氫活性復(fù)合體中各亞基之間的相互作用關(guān)系。NAGPR

4、抗體免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)LPD2和Cpn20可以得到共純化，但是在LPD2抗體免疫共沉淀和Cpn20免疫共沉淀中只分別得到了Cpn20和LPD2，而沒(méi)有NAGPR被共沉淀。這些結(jié)果說(shuō)明在這個(gè)類似交替型NAD(P)H脫氫酶復(fù)合體中，LPD2和Cpn20之間有直接相互作用，而LPD2，Cpn20和NAGPR的之間的相互作用還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　 3.在煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行串聯(lián)親和純化實(shí)驗(yàn)。在煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)中，LPD2-TAPa和NA

5、GPR-TAPa表達(dá)水平理想，說(shuō)明重組的真核表達(dá)載體中目的基因沒(méi)有發(fā)生任何突變，而且實(shí)現(xiàn)了和串聯(lián)親和純化標(biāo)簽的融合表達(dá)。但是在煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中經(jīng)過(guò)串聯(lián)親和純化過(guò)程得到的LPD2-TAPa和NAGPR-TAPa復(fù)合體在western-blot中顯示出顯著的非特異性條帶，這說(shuō)明煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)不適合用來(lái)進(jìn)行外源性蛋白復(fù)合體及外源性蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系的研究。
　　 4.在擬南芥穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行串聯(lián)親和純化實(shí)驗(yàn)，體內(nèi)分析LP

6、D2，Cpn20和NAGPR之間的相互作用關(guān)系。LPD2-ATPa的轉(zhuǎn)基囚擬南芥全蛋白經(jīng)過(guò)IgGBeads純化，SDS-PAGE分離和western-blot檢測(cè)，以TPAa-GFP為陰性對(duì)照，在LPD2-TAPa復(fù)合體中檢測(cè)到了Cpn20的存在，但是未檢測(cè)到NAGPR；在NAGPR-ATPa的轉(zhuǎn)基因擬南芥全蛋白經(jīng)過(guò)IgG Beads純化，SDS-PAGE分離和western-blot檢測(cè)，在NAGPR-TAPa復(fù)合體中未檢測(cè)到Cpn2

7、0的存在，同時(shí)通過(guò)TAPa-GFP陰性對(duì)照的對(duì)比，證實(shí)LPD2與NAGPR的結(jié)合為非特異性結(jié)合，兩者之間沒(méi)有特異性相互作用。
　　 以上研究結(jié)果表明，在擬南芥線粒體可溶性部分中分離得到的具有交替型NAD(P)H脫氫酶活性的復(fù)合體中，Cpn20作為復(fù)合體亞基，和亞基LPD2之間存在特異性相互作用，它們結(jié)合在一起，存在于一個(gè)復(fù)合體中。這是首次揭示他們之間的相互作用。我們推測(cè)Cpn20可能協(xié)助LPD2進(jìn)入線粒體后正確折疊，此外，他們之