2023年全國碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、臨床研究及實(shí)驗表明,基因治療的關(guān)鍵在于載體的選擇。發(fā)展至今,不同時(shí)期已有多種不同的載體應用于基因治療中,如逆轉錄病毒載體、單純皰疹病毒載體、慢病毒載體、腺病毒及腺相關(guān)病毒載體等。各種載體都具有各自的優(yōu)點(diǎn)及缺陷。腺病毒載體的結構及功能研究較為清楚,因其致病原性低,宿主范圍廣泛,包裝生產(chǎn)簡(jiǎn)單,可同時(shí)表達多個(gè)基因等優(yōu)勢在基因治療中被廣泛應用;但是腺病毒同樣存在靶向性差,表達外源基因時(shí)間短,容易引起較為強烈的免疫反應等諸多缺陷。
  

2、目前國際上較為公認的腺相關(guān)病毒(AAV)載體可以在一定程度上彌補這些不足。AAV對人體免疫原性低,幾乎無(wú)致病性,可介導目的基因長(cháng)效表達,并且宿主范圍極為廣泛,能感染不同細胞周期的多種類(lèi)型細胞。己發(fā)現的AAV血清型至少有150多種,不同血清型的AAV可以靶向不同的細胞和組織,進(jìn)一步擴大了AAV的應用范圍。
   AAV1因其可以高效靶向骨骼肌,攜帶外源基因應用于臨床研究和治療更為安全,已經(jīng)越來(lái)越多的被作為基因治療載體用于多種疾病的

3、治療。但是臨床研究對AAV1的需求量極高,一般滴度要達到1017VG/ml。傳統的質(zhì)粒轉染生產(chǎn)方式所得到的AAV容易被腺病毒污染,并且耗時(shí)耗力,過(guò)程繁瑣,實(shí)際操作很難達到臨床需要的用量。
   本研究采用二桿狀病毒-昆蟲(chóng)細胞生產(chǎn)系統,期望探索出一套rAAV1規?;b生產(chǎn)的穩定方法。桿狀病毒能夠為Aav的復制包裝提供必要的輔助元件,并且桿狀病毒不會(huì )像腺病毒和單純皰疹病毒一樣對人體產(chǎn)生毒性,又借助對昆蟲(chóng)細胞Sf9的感染性,在昆蟲(chóng)細

4、胞中懸浮生產(chǎn)重組AAV載體,是一種較為理想且能滿(mǎn)足臨床需求的新型重組AAV生產(chǎn)方式。
   本研究首先構建完成了三個(gè)攜帶了AAV包裝所需的順式和反式作用元件的重組pFastBacDual質(zhì)粒:pFBD-AAV1RepiCapi和pFBD-AAV1RFP、pFBD-AAV1AT7(Avastin):利用重組pFastBacDual質(zhì)粒轉化DH10TMBac感受態(tài)菌株,獲得Bac-AAV1RepiCapi和Bac-AAV1RFP、B

5、ac-AAV1AT7(Avastin),滴度分別為5.42×108 VG/ml、2.63×108VG/ml、5.95×1012VG/ml;采取二桿狀病毒系統成功包裝出重組AAV病毒rAAVlRFP、rAAV1-AT7(Avastin),rAAV1-RFP。100ml錐形瓶中包裝出的rAAV1-RFP病毒產(chǎn)量為3.7×1013vg,可達35TU/Cell,生產(chǎn)能力較強;利用rAAV1-RFP感染細胞,熒光顯微鏡下觀(guān)察紅色熒光效果理想;運用

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