利用桿狀病毒系統(tǒng)規(guī)模化生產(chǎn)rAAV1的研究.pdf

1、臨床研究及實驗表明,基因治療的關(guān)鍵在于載體的選擇。發(fā)展至今,不同時期已有多種不同的載體應(yīng)用于基因治療中,如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、單純皰疹病毒載體、慢病毒載體、腺病毒及腺相關(guān)病毒載體等。各種載體都具有各自的優(yōu)點及缺陷。腺病毒載體的結(jié)構(gòu)及功能研究較為清楚,因其致病原性低,宿主范圍廣泛,包裝生產(chǎn)簡單,可同時表達多個基因等優(yōu)勢在基因治療中被廣泛應(yīng)用;但是腺病毒同樣存在靶向性差,表達外源基因時間短,容易引起較為強烈的免疫反應(yīng)等諸多缺陷。
　　

2、目前國際上較為公認(rèn)的腺相關(guān)病毒(AAV)載體可以在一定程度上彌補這些不足。AAV對人體免疫原性低,幾乎無致病性,可介導(dǎo)目的基因長效表達,并且宿主范圍極為廣泛,能感染不同細(xì)胞周期的多種類型細(xì)胞。己發(fā)現(xiàn)的AAV血清型至少有150多種,不同血清型的AAV可以靶向不同的細(xì)胞和組織,進一步擴大了AAV的應(yīng)用范圍。
　　 AAV1因其可以高效靶向骨骼肌,攜帶外源基因應(yīng)用于臨床研究和治療更為安全,已經(jīng)越來越多的被作為基因治療載體用于多種疾病的

3、治療。但是臨床研究對AAV1的需求量極高,一般滴度要達到1017VG/ml。傳統(tǒng)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染生產(chǎn)方式所得到的AAV容易被腺病毒污染,并且耗時耗力,過程繁瑣,實際操作很難達到臨床需要的用量。
　　 本研究采用二桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞生產(chǎn)系統(tǒng),期望探索出一套rAAV1規(guī)模化包裝生產(chǎn)的穩(wěn)定方法。桿狀病毒能夠為Aav的復(fù)制包裝提供必要的輔助元件,并且桿狀病毒不會像腺病毒和單純皰疹病毒一樣對人體產(chǎn)生毒性,又借助對昆蟲細(xì)胞Sf9的感染性,在昆蟲細(xì)

4、胞中懸浮生產(chǎn)重組AAV載體,是一種較為理想且能滿足臨床需求的新型重組AAV生產(chǎn)方式。
　　 本研究首先構(gòu)建完成了三個攜帶了AAV包裝所需的順式和反式作用元件的重組pFastBacDual質(zhì)粒:pFBD-AAV1RepiCapi和pFBD-AAV1RFP、pFBD-AAV1AT7(Avastin):利用重組pFastBacDual質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10TMBac感受態(tài)菌株,獲得Bac-AAV1RepiCapi和Bac-AAV1RFP、B

5、ac-AAV1AT7(Avastin),滴度分別為5.42×108 VG/ml、2.63×108VG/ml、5.95×1012VG/ml;采取二桿狀病毒系統(tǒng)成功包裝出重組AAV病毒rAAVlRFP、rAAV1-AT7(Avastin),rAAV1-RFP。100ml錐形瓶中包裝出的rAAV1-RFP病毒產(chǎn)量為3.7×1013vg,可達35TU/Cell,生產(chǎn)能力較強;利用rAAV1-RFP感染細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察紅色熒光效果理想;運用