GSAT與WTAP蛋白的克隆、表達(dá)純化以及初步晶體學(xué)分析.pdf

1、本文主要內(nèi)容如下：
　　1.GSAT的克隆,表達(dá)和純化以及初步晶體學(xué)分析
　　5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acid,ALA)是四碳合成途徑當(dāng)中首要的供體,植物,藻類和一些細(xì)菌也可以通過五碳途徑從谷氨酸合成5-氨基酮戊酸。在這個途徑中一系列的酶發(fā)揮著重要的作用,谷氨酸-1-半醛轉(zhuǎn)氨酶(Glutamate-1-semialdehyde aminotransferase,GSAT)是這個途徑的最后一個酶。其他

2、兩個重要的酶是谷氨酸-tRNA合成酶和谷氨酸-tRNA還原酶。谷氨酸-1-半醛轉(zhuǎn)氨酶在促使谷氨酸合成5-氨基酮戊酸過程中發(fā)揮最重要的作用。
　　我們從基因組文庫中克隆了GSAT的CDS序列,并構(gòu)建了GSAT-p28a質(zhì)粒。重組蛋白GSAT-HisTag在E.coli BL21(DE3)中表達(dá)量高,用Ni親和柱純化后純度達(dá)到95％以上。蛋白質(zhì)在濃縮和脫鹽過程中比較穩(wěn)定,動態(tài)光散射實驗證實重組蛋白不存在多聚現(xiàn)象。用懸滴氣相擴(kuò)散法經(jīng)過篩

3、選和優(yōu)化得到了GSAT的結(jié)晶。X-Ray衍射表明晶體的衍射分辨率可達(dá)到2.0埃。完成了晶體衍射數(shù)據(jù)的收集,晶體空間群為C2,晶胞參數(shù)為a=111.428埃,b=56.469(?)埃,c=81.028埃,β=131.928°。分析計算和自旋patterson函數(shù)計算均表明,一個晶體學(xué)不對稱單位含有一個蛋白質(zhì)分子。以Synechococcus的GSAT(3GSB)為結(jié)構(gòu)模型,用分子置換法已獲得結(jié)構(gòu)的初相位解析。結(jié)構(gòu)模型的精化過程正在進(jìn)行中。

4、
　　2.WTAP的克隆,表達(dá),純化和結(jié)構(gòu)研究
　　腎細(xì)胞腫瘤抑制基因WT1對于泌尿生殖系統(tǒng)的發(fā)育有很重要的作用。雖然很多目的蛋白基因已經(jīng)鑒別和一些WT1結(jié)合蛋白已經(jīng)獲得,但是對于WT1的作用機(jī)制還是沒有研究清楚。我們所研究的蛋白WTAP即腎細(xì)胞腫瘤抑制基因WT1相關(guān)蛋白,由于其特別的表達(dá)方式,因而可能表明其具有一些基本的細(xì)胞內(nèi)功能。由于WTAP是一個細(xì)胞核內(nèi)蛋白,和WT1基因一樣通過核質(zhì).雖然兩者之間的相互作用還沒有明確，

5、但是從現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，WTAP是一個具有重要意義的蛋白。
　　在WT1上有兩個可以選擇的剪切位點，一個是17個氨基酸，含有5個外顯子;第二個可以增加與刪除的是三個氨基酸(KTS)即賴氨酸，蘇氨酸和絲氨酸，存在于第9與第十個外顯子之間。根據(jù)著兩個位點的存在與否，WT1可以劃分為主要的四種異構(gòu)體。文獻(xiàn)報道的研究結(jié)果表明，WT1發(fā)揮作用是必須與IYTAP相互結(jié)合。通過其序列分析，我們認(rèn)為這個結(jié)合位點應(yīng)該在N端，所以設(shè)計實驗來進(jìn)而證明