菊酯農(nóng)藥降解酶基因的表達(dá)、純化以及生物信息學(xué)分析.pdf

1、擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑在家庭衛(wèi)生和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用已有四十多年的歷史，其廣泛應(yīng)用所產(chǎn)生的大量積累和殘留，造成環(huán)境污染，妨礙生物生長(zhǎng)，并直接或間接地危害著人體健康。發(fā)展一種有效方法消除或降低食品和環(huán)境中的菊酯農(nóng)藥殘留已成為當(dāng)前迫切需要解決的問(wèn)題，采用微生物農(nóng)藥降解酶解決農(nóng)藥殘留污染問(wèn)題已成為當(dāng)前環(huán)境科學(xué)研究的熱點(diǎn)，而且也是一個(gè)較新的研究領(lǐng)域。 酯酶(Esterase，EC3.1.1.1)屬于水解酶類(lèi)，是能夠催化水解羧酸酯的所有酶的總

2、稱(chēng)，具有菊酯農(nóng)藥降解活性的酯酶在自然界中廣泛存在。在過(guò)去的研究工作中，本實(shí)驗(yàn)室獲得了一株能以菊酯為唯一碳源和氮源生長(zhǎng)的伯雷克氏菌株Klebsiellasp.ZD112，通過(guò)構(gòu)建基因文庫(kù)的方式，獲得了新的菊酯農(nóng)藥降解酶基因(pyrethroid-hydrolyzingesterase，estP)。這是有關(guān)微生物來(lái)源的菊酯農(nóng)藥降解酶基因的第一次報(bào)道，對(duì)estP進(jìn)行基因改造以及表達(dá)研究，獲得可用于生物修復(fù)的高效菊酯農(nóng)藥降解酶工程菌，具有重要的

3、社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)意義。 EstP由638個(gè)氨基酸所編碼，預(yù)測(cè)分子量為73.4kDa，pI值為8.34。EstP與其它蛋白相似性極低，不屬于任何已知的蛋白超家族。本文通過(guò)對(duì)EstP的生物信息學(xué)分析，證實(shí)其屬于水解酶類(lèi)。分析還發(fā)現(xiàn)，EstP與羧肽酶Taq(M32)的保守域具有一定相似性，由多序列比對(duì)分析推測(cè)Lys137，Glu116，Glu148是EstP的必需氨基酸。此外，本文還對(duì)EstP的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)。

4、 本文以Klebsiellasp.ZD112的總基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增出estP基因，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET32a-EstP，熱激轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coliBL21(DE3)，28℃條件下，用終濃度為0.4mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳分析表明，有分子量約為74kDa的目的蛋白大量表達(dá)，表達(dá)的蛋白多為包涵體，小部分具可溶性。酶活力測(cè)定證明，可溶蛋白具酯酶活性，對(duì)氯氰菊酯有較強(qiáng)的降解能力。使用Ni2+鰲合劑對(duì)包涵體蛋白進(jìn)行

5、純化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)咪唑濃度達(dá)到300mM時(shí)，即可將目的蛋白置換下來(lái)。 為了克服原核融合表達(dá)生成的活性蛋白含量低的缺陷，實(shí)現(xiàn)菊酯農(nóng)藥降解酶的高效分泌表達(dá)，本文將克隆的酶基因連接在酵母分泌表達(dá)載體pPICZαA上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZαA-EstP，用電轉(zhuǎn)化的方法將重組質(zhì)粒pPICZαA-EstP整合在畢赤酵母PichiapastorisX33的染色體上，篩選高拷貝克隆進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。然而，未能觀(guān)察到目的蛋白的生成。 總之