詹氏甲烷球菌NifH1和釀酒酵母Ndl1的克隆、表達(dá)、純化及初步晶體學(xué)分析.pdf

1、1.固氮作用是由固氮菌中的固氮復(fù)合物完成的。固氮復(fù)合物由固氮酶和固氮還原酶組成，其中固氮酶是一個(gè)由NifD和NifK蛋白組成的α2β2異四聚體，固氮還原酶是一個(gè)由NifH蛋白組成的同二聚體。目前，已經(jīng)在沒有固氮作用的嗜熱產(chǎn)烷生物詹氏甲烷球菌中發(fā)現(xiàn)了固氮酶NifD/K和NifH同源物的表達(dá)（命名為NflD/K和NlfH，Nfl=Nif-like，M.Jannaschii中的NlfH在這里被稱作Mj.NifH1），但是其功能還不清楚。解出M

2、j.NifH1的晶體結(jié)構(gòu)將對(duì)理解其功能以及了解其在進(jìn)化上的作用提供很大的幫助。
　　 在本課題中，構(gòu)建了Mj.NifH1的表達(dá)載體，并通過鎳柱親和和HiLoad 16/60 SuperdeX200 size-exclusion column凝膠層析等方法得到了純化后的目的蛋白。目的蛋白通過懸滴氣相擴(kuò)散法在287K進(jìn)行晶體生長(zhǎng)，并得到可以進(jìn)行X射線衍射和數(shù)據(jù)收集的蛋白晶體。在上海同步輻射加速器收集到一套最高分辨率為3.3的衍射數(shù)據(jù)

3、。晶體的空間群是P4132，晶胞參數(shù)為a=b=c=139.45，確定每個(gè)不對(duì)稱單位含有一個(gè)蛋白分子。
　　 2.動(dòng)力蛋白(Dynein）是一種細(xì)胞中的馬達(dá)蛋白，可以將包含ATP在內(nèi)的化學(xué)能轉(zhuǎn)換為運(yùn)動(dòng)過程中的機(jī)械能，在有絲分裂、膜轉(zhuǎn)運(yùn)和胞內(nèi)運(yùn)輸中起著關(guān)鍵作用。動(dòng)力蛋白作用的發(fā)揮需要許多蛋白的共同協(xié)調(diào)作用，如NUDEL家族中的一員Ndl1，對(duì)于動(dòng)力蛋白正常地定位到動(dòng)粒上非常關(guān)鍵。Ndl1可以激活動(dòng)力蛋白調(diào)節(jié)的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，而當(dāng)它結(jié)合到分

4、裂激素和動(dòng)力蛋白時(shí)，可以穩(wěn)定動(dòng)力蛋白或動(dòng)力蛋白激活蛋白，使其不會(huì)進(jìn)行微管依賴的脫落過程，從而進(jìn)一步產(chǎn)生分子馬達(dá)的作用。Ndl1缺失時(shí)會(huì)導(dǎo)致結(jié)合到微管正極的動(dòng)力蛋白減少，從而影響有絲分裂等過程。
　　 在本課題中，為獲得釀酒酵母中Ndl1蛋白(Sc.Ndl1)的晶體結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步了解其發(fā)揮功能的分子機(jī)制提供線索，構(gòu)建了Sc.Ndl1的表達(dá)載體，并表達(dá)、純化得到目的蛋白，并進(jìn)行晶體生長(zhǎng)。目前得到一顆Sc.Ndl1蛋白晶體，晶體優(yōu)化正