Thermus Thermophilus HB27蘋果酸脫氫酶基因的克隆表達、酶抑制動力學及蛋白折疊研究.pdf

1、蘋果酸脫氫酶(Malate dehydrogenase,EC1.1.1.37,MDH)是一種重要的糖代謝酶,在生物體內特異性催化L-蘋果酸成為草酰乙酸從而完成三羧酸循環(huán)(TCA)?？衫肕DH底物專一性特征,將其用于拆分DL-蘋果酸以得到重要的手性碳源(D-蘋果酸)。此外,MDH具有同源二聚體分子結構,這一結構的特殊性決定了MDH常被用作于寡聚蛋白分子的結構及功能研究的模型分子。鑒于MDH重要的經濟及科研價值,本研究從嗜熱菌Thermu

2、sthermophilus HB27中克隆獲得Tt-MDH基因,并在大腸桿菌中成功表達,重組蛋白可溶的且具有生物學活性;建立了簡單可行的純化流程,獲得了高純度并具熱穩(wěn)定的目的蛋白,并對其生物化學性質、去折疊和再折疊過程進行了詳細的研究。
　　 以L-蘋果酸和NAD+為底物,研究了不同的pH、溫度和金屬離子對Tt-MDH活性的影響,結果顯示其最適pH為11.5,最適溫度為80℃。Mn2+和Ni2+對Tt-MDH的活性都有激活作用,

3、其激活能力依次下降;而Ca2+,和Cu2+表現(xiàn)出抑制效應。結果表明Tt-MDH可能在幫助Thermus thermophilus HB27適應極端溫度和特定的生存環(huán)境方面發(fā)揮著重要的生理作用。
　　 利用此高純度的Tt-MDH,我們進行了由鹽酸胍誘導的Tt-MDH抑制動力學的研究,鹽酸胍使Tt-MDH變性是一個兩相反應動力學過程,Tt-MDH的活性顯示了一種時間依賴的抑制方式,Icso值為為1.45 mol/L。熒光光譜分析結果

4、表明鹽酸胍通過誘導疏水面的暴露從而改變Tt-MDH高級結構。對于Tt-MDH的再折疊過程中osmolytes的防聚沉作用實驗表明:osmolytes的加入會使胍變性Tt-MDH復性過程中的聚沉量大大下降,誘導正確的折疊方式。
　　 本研究對于理解這一新的熱穩(wěn)定性Tt-MDH的耐熱機制、折疊機理、結構和功能,并為構建高效耐熱的工程菌及其工業(yè)化應用提供了一些有用的信息,同時,對于以Tt-MDH為藥物作用靶標研發(fā)其抑制劑類藥物,以期治