嗜熱菌Thermus thermophiles HB8丙酮酸脫氫酶的表達及其酶動力學測定.pdf

1、嗜熱酶(thermozymes)是嗜熱菌(thermopHiles)體內的一種熱穩(wěn)定性酶,其能夠適應自然界中較高的溫度條件并能在該惡劣環(huán)境中保持良好的生理狀態(tài)。由于嗜熱酶所具有的這種特性,其可以在許多依賴高溫條件的工業(yè)生產過程中替代常規(guī)的、不耐熱的化學試劑和常溫酶,從而提高酶促反應速度,降低微生物污染的危險性,這些特點讓這種酶在大規(guī)模工業(yè)生產中有更廣闊的應用范圍和更低的成本投入、更高的回報比例,因此這方面的研究具有可觀的經濟前景。本實驗

2、所研究的目的蛋白丙酮酸脫氫酶(E1蛋白)即是這樣一種重要的嗜熱酶。通過催化丙酮酸的氧化脫羧從而為三羧酸循環(huán)和激素合成輸送乙酰輔酶A,丙酮酸脫氫酶復合體(PDC)在糖代謝中扮演了一個非常關鍵的角色。E1為PDC的重要組成部分,它催化了整個反應體系中非常關鍵的第一步： 本論文實驗以嗜熱菌thermos thermopHiles HB8為材料,通過PCR技術擴增大腸桿菌丙酮酸脫氫酶(E1)基因,并將目的基因分別連接到克隆載體pGEM

3、-T和表達載體pTrcHisC上,構建重組質粒。重組質粒pTrcHisC-E1在大腸桿菌中于20～25℃的溫度下誘導4～6小時表達。利用Ni-NTA金屬親和層析的方法從總蛋白中提取E1蛋白,然后通過透析超濾管濃縮獲得純度、濃度較高的E1蛋白溶液,最后采用鐵氰化鉀法對其進行酶動力學測定。本實驗成功構建了表達丙酮酸脫氫酶基因的載體,誘導表達并純化出了具有酶反應活性的丙酮酸脫氫酶,經過酶動力學測定得到該嗜熱菌E1的下列酶活性數據：其最適反應溫