丙酮酸脫氫酶系測活方法的比較研究與創(chuàng)新.pdf

1、丙酮酸脫氫酶系或丙酮酸脫氫酶復合體(PDHc)是催化丙酮酸氧化脫羧生成乙酰-CoA代謝過程中起著關鍵的作用的一種酶系。丙酮酸脫氫酶活性的測定在丙酮酸脫氫酶系的性質、基因克隆、分離、純化、鑒定及相關研究中都是必不可少的；對于研究丙酮酸脫氫酶系的結構與性質、分離、純化及鑒定具有重要的理論意義；同時對于研究與丙酮酸的代謝異常有關的疾病，以酮酸脫氫酶系為靶標的除草劑和殺菌劑的篩選與開發(fā)也具有重要的現(xiàn)實意義。 目前己有報導的丙酮酸脫氫酶系

2、活性測定方法幾乎都是二十世紀五六十年代就發(fā)展起來的。根據(jù)使用的手段可分為放射性同位素標記法和分光光度法。同位素標記法主要用于粗酶液，是基于<'14>C丙酮酸經(jīng)過E1(PDH)的催化作用轉CO<,2>，可以通過測定<'14>C標記的CO<,2>生成量來決定E1酶的活性。分光光度法有測定丙酮酸脫氫酶復合體活性的還原型輔酶Ⅰ法、碘硝基四唑紫法，測定丙酮酸脫氫酶復合體中E1酶活性的2，6-二氯吲哚酚法和鐵氰化鉀法。 同位素標記法是采用動

3、態(tài)的測量，沒有分光光度法便利，同時它還用到一種相對不穩(wěn)定的放射性物質，易造成環(huán)境污染。所以本研究重點放在對測定該酶的分光光度法的研究上，通過采用同一種測活方法測定不同來源的丙酮酸脫氫酶的酶活性，或者用不同的測活方法測定同一種丙酮酸脫氫酶的酶活性等實驗手段，對常用的幾種分光光度法的靈敏度，干擾因素等方面進行了比較性的研究，同時也開創(chuàng)性的發(fā)明了一種新的測活方法。 研究發(fā)現(xiàn)：常用測定丙酮酸脫氫酶活性的方法中：鐵氰化鉀法的靈敏度極低；2

4、，6-二氯吲哚酚法靈敏度較高，但易受到疏基保護劑的影響。測定還原型輔酶Ⅰ(NADH)形成速率的標準分光光度法常被用于純化的丙酮酸脫氫酶復合體活性的測定，這種方法由于易受到丙酮酸脫氫酶復合體反應產(chǎn)物的副反饋抑制而受到限制，且試劑價格昂貴。1981年Hinman LM等人報道了一種在粗的均質液中測定丙酮酸脫氫酶復合體活性的分光光度計法方法，此方法被用于測定粗的均質液和線粒體制備后的丙酮酸脫氫酶酶活性的測定。經(jīng)過本研究發(fā)現(xiàn)：本應該與丙酮酸脫氫

5、酶復合體中三個酶的共同產(chǎn)物NADH反應的碘硝基四唑紫，不僅能與NADH反應，它同時也能與丙酮酸脫氫酶復合體中第一個酶丙酮酸脫氫酶(E1)的產(chǎn)物直接發(fā)生作用；這種方法也易受到疏基保護劑的影響，所以這種方法測定丙酮酸脫氫酶復合體的可靠性值得進一步商榷。 由于現(xiàn)有的方法在測定丙酮酸脫氫酶系活性時不同程度的存在著這樣那樣的缺點，所以本研究在對丙酮酸脫氫酶系的測活方法系統(tǒng)研究基礎上，建立了一種新的、經(jīng)濟有效的測活方法。該方法的原理是基于偶

6、連丙酮酸脫氫酶復合體中E1的產(chǎn)物對噻唑藍(MTT)的還原，使最大吸收峰從420nm(黃色)左右紅移到570nm(藍色)左右。噻唑藍的作用是作為電子受體。結果顯示：這種方法所用的試劑比較經(jīng)濟，靈敏度比2，6-DCPIP法和鐵氰化鉀法高，同時它穩(wěn)定性好，克服了2，6-DCPIP法易受疏基保護劑影響，不利于測定丙酮酸脫氫酶復合體中E1的活性的缺點，它既適用于純化的PDH也適用于來自線粒體的提取后的PDH<,C>中的PDH(E1)，也適用于一定