丙酮酸脫氫酶激酶-1在結(jié)腸癌中的表達(dá)及在細(xì)胞增殖和化療中的作用.pdf

1、背景與目的：
　　 結(jié)直腸癌是臨床最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,由于生活習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)的改變,其發(fā)病率和死亡率均有逐年升高的趨勢(shì),資料顯示我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率正以年均4.2％的速度增長(zhǎng)。手術(shù)和化療是結(jié)直腸癌的常規(guī)治療手段,雖然在一定程度上緩解了患者的痛苦,延長(zhǎng)其壽命,但還存在著一定的缺陷。對(duì)于中晚期結(jié)直腸癌患者而言,手術(shù)效果差,化療卻面臨越來(lái)越頻繁的耐藥難題,因此,探尋治療結(jié)直腸癌和提高化療效果的新策略是目前非常迫切的任務(wù)。
　　

2、 早在20世紀(jì)20年代,Otto Warburg就提出,腫瘤細(xì)胞能夠通過(guò)糖酵解途徑在缺乏氧的條件下獲得能量,有些腫瘤細(xì)胞甚至在獲得充足氧氣時(shí)仍繼續(xù)依賴(lài)糖酵解途徑產(chǎn)能,腫瘤細(xì)胞這一特殊生化表型,被稱(chēng)為Warburg效應(yīng)。因此,活躍的糖酵解代謝是惡性腫瘤細(xì)胞顯著的生化特征,是腫瘤細(xì)胞能量ATP的重要來(lái)源。臨床上已利用腫瘤細(xì)胞特異性的Warburg效應(yīng),通過(guò)正電子發(fā)射斷層顯像(positron emissiontomography,PET)

3、技術(shù)來(lái)診斷惡性腫瘤,而探索通過(guò)干預(yù)糖酵解代謝途徑來(lái)治療惡性腫瘤的策略正越來(lái)越受矚目。
　　 丙酮酸脫氫酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase,PDK)是細(xì)胞糖酵解關(guān)鍵限速酶丙酮酸脫氫酶(PDH)的調(diào)節(jié)酶。在人類(lèi)和嚙齒類(lèi)動(dòng)物中目前鑒定出有4種PDK同工酶:PDKI、PDK2、PDK3以及PDK4。其中PDK1在心臟、胰島和骨骼肌中被檢測(cè)到微量表達(dá),在PDH磷酸化過(guò)程中發(fā)揮重要的功能,尤其在PDH長(zhǎng)期調(diào)節(jié)

4、中尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)PDK1的表達(dá)可被缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α調(diào)控,可能與腫瘤缺氧的環(huán)境有關(guān)。近年研究表明,PDK1除了具有糖代謝酶的催化活性,對(duì)細(xì)胞凋亡拮抗還有一定的影響,藥物抑制PDK1可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。體外細(xì)胞培養(yǎng)顯示,HIF-1α和PDK1在頭頸部癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌等細(xì)胞中表達(dá)增高。但HIF-1α和PDK1在人結(jié)腸癌組織中的表達(dá)和關(guān)系尚不清楚,PDK1在結(jié)腸癌中的表達(dá)、治療意義以及其相關(guān)作用機(jī)制還尚不明確。
　　

5、 化療作為結(jié)腸癌的重要治療手段,目前效果并不理想,尤其單藥化療已經(jīng)被聯(lián)合化療所取代。PDK-1蛋白兼有促進(jìn)能量ATP合成和影響凋亡的雙重功能,因此推測(cè)PDK-1與結(jié)直腸癌化療有關(guān),抑制PDK1可能增強(qiáng)化療藥物的治療效果。
　　 線(xiàn)粒體功能的調(diào)節(jié)在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要的功能。以往研究表明,惡性腫瘤細(xì)胞中線(xiàn)粒體的結(jié)構(gòu)和功能均發(fā)生了一定的變化,線(xiàn)粒體膜結(jié)構(gòu)不完整,且糖酵解途徑獲能導(dǎo)致線(xiàn)粒體膜靜息電位高于正常,這些使得

6、惡性腫瘤細(xì)胞的增殖被促進(jìn)而凋亡被抑制。相關(guān)研究指出抑制PDK1能改善結(jié)構(gòu)和功能,降低線(xiàn)粒體膜電位。但是這一效是否也是引起結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的機(jī)制之一尚需實(shí)驗(yàn)證實(shí)。
　　 本課題擬檢測(cè)HIF-1α和PDK1在人結(jié)腸癌組織中的表達(dá),觀(guān)察HIF-1α與PDK1的關(guān)系;比較PDK1在正常組織和結(jié)腸癌組織中表達(dá)的區(qū)別與病理聯(lián)系,以期說(shuō)明PDK1的表達(dá)與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。通過(guò)抑制PDK1,觀(guān)察結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、化療藥物協(xié)同作用、凋亡相

7、關(guān)因子和線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)和功能的變化,以探討PDK1在結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和化療中的作用及機(jī)制。
　　 方法
　　 1、通過(guò)免疫組織化學(xué)染色及免疫熒光雙標(biāo)染色技術(shù)觀(guān)察結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中HIF-1α與PDK-1的表達(dá)和分布情況,了解二者在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的關(guān)系及與腫瘤分期、淋巴轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)的關(guān)系。
　　 2、采用RT-PCR、real-time PCR和免疫熒光、Western印跡法,檢測(cè)人結(jié)腸癌組織和4種人結(jié)腸癌細(xì)胞

8、株P(guān)DK-1基因和蛋白表達(dá)。
　　 3、應(yīng)用MTT、BrdU摻入法、Hoeehst33258核染色及Annex-V雙染色法,觀(guān)察PDKl阻斷劑(Dichloroacetate,DCA)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞活性、增殖、凋亡和化療的影響。
　　 4、通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位(mitochondfia membrane voltage,△ψm)、胞內(nèi)鈣離子濃度,探討抑制PDK1與線(xiàn)粒體功能異常導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡的關(guān)系。
　　

9、 5、在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,將LoVo細(xì)胞接種于裸鼠右側(cè)腋下,用PDK1抑制劑和兩種結(jié)腸癌常用化療藥物處理4周,測(cè)量皮下瘤體積并稱(chēng)重,免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)腫瘤組織Caspase-3和PCNA表達(dá)。
　　 結(jié)果
　　 1、結(jié)直腸癌組織觀(guān)察到HIF-1α主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞的胞漿和(或)胞核,腫瘤壞死明顯的區(qū)域內(nèi)和腫瘤浸潤(rùn)邊緣尤為多見(jiàn),PDK1表達(dá)主要定位于腫瘤細(xì)胞的胞漿;HIF-1α的表達(dá)陽(yáng)性率為78.04％,PDK1表達(dá)的陽(yáng)性率

10、為76.20％,與癌旁結(jié)腸壁組織相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。二者的表達(dá)不受患者性別、年齡、腫瘤位置和腫瘤大小的影響(P＞0.05);低分化腫瘤HIF-1α與PDK1的陽(yáng)性表達(dá)率高于高分化腫瘤(P＜0.05);腫瘤有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者HIF-1α與PDK1的陽(yáng)性表達(dá)率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P＜0.05);隨著Dukes分期進(jìn)展,HIF-1α與PDK1陽(yáng)性表達(dá)率逐漸增高,C、D期表達(dá)情況較A、B期有顯著差異(P＜0.05);二者在結(jié)直腸癌

11、組織中的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(Y=0.727,P＜0.01);免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果顯示HIF-1α與PDK1在結(jié)直腸癌組織中明確存在共表達(dá)現(xiàn)象。
　　 2、PDK1基因mRNA和蛋白在人結(jié)腸癌LS173T、LOVo、HT-29和SW620細(xì)胞中均明顯表達(dá),其中LoVo細(xì)胞中表達(dá)最高。
　　 3、不同濃度(O-90mmol/L)DCA分別作用LoVo、LS174T、HT-29、SW620細(xì)胞48h,結(jié)腸癌細(xì)胞活性和增殖均受到明

12、顯抑制。小劑量DCA(2.5mmol/L、5 mmol/L)分別與化療藥物(5-FU和OXA)聯(lián)合作用LoVo細(xì)胞48h。檢測(cè)顯示,與5FU、OXA單獨(dú)作用LoVo細(xì)胞相比,聯(lián)合小劑量DCA對(duì)細(xì)胞活性和增殖的抑制作用更加明顯,數(shù)據(jù)分析后顯示小劑量DCA與5FU、OXA均有協(xié)同作用。
　　 4、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度(O-30mmol/L)DCA分別作用LoVo、LS174T、HT-29、SW620細(xì)胞48h,結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡明顯增

13、加。小劑量DCA聯(lián)合5FIJ和OXA后凋亡細(xì)胞比例明顯高于5FU和OXA單獨(dú)作用,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。同時(shí),在DCA作用下,LoVo細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位和胞內(nèi)鈣離子濃度均下降,且聯(lián)合5FU和OXA后下降效果更加明顯。
　　 5、裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,三組LoVo移植瘤分別用DCA、OXA及兩者聯(lián)合用藥處理后,皮下瘤平均體積和平均重量均明顯小于對(duì)照組移植瘤(P＜0.01)。與對(duì)照組比,三組藥物處理的LoVo細(xì)胞皮下瘤增殖指數(shù)顯

14、著下降,而凋亡指數(shù)則明顯升高。
　　 結(jié)論
　　 1、HIF-1α與PDK1在結(jié)腸癌組織中存在過(guò)表達(dá)和共表達(dá)現(xiàn)象,其表達(dá)不受患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小的影響,但在不同分化程度、不同Dukes分期和是否伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素中二者表達(dá)陽(yáng)性率呈顯著差異,且二者表達(dá)呈顯著正相關(guān)。
　　 2、PDK1阻斷劑DCA可通過(guò)降低線(xiàn)粒體膜電位,增加線(xiàn)粒體膜通透性等機(jī)制來(lái)誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。
　　 3、抑制PDKl可