丙酮酸脫氫酶激酶-1在結(jié)腸癌中的表達及在細胞增殖和化療中的作用.pdf

1、背景與目的：
　　 結(jié)直腸癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一,由于生活習慣和飲食結(jié)構(gòu)的改變,其發(fā)病率和死亡率均有逐年升高的趨勢,資料顯示我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率正以年均4.2％的速度增長。手術(shù)和化療是結(jié)直腸癌的常規(guī)治療手段,雖然在一定程度上緩解了患者的痛苦,延長其壽命,但還存在著一定的缺陷。對于中晚期結(jié)直腸癌患者而言,手術(shù)效果差,化療卻面臨越來越頻繁的耐藥難題,因此,探尋治療結(jié)直腸癌和提高化療效果的新策略是目前非常迫切的任務。
　　

2、 早在20世紀20年代,Otto Warburg就提出,腫瘤細胞能夠通過糖酵解途徑在缺乏氧的條件下獲得能量,有些腫瘤細胞甚至在獲得充足氧氣時仍繼續(xù)依賴糖酵解途徑產(chǎn)能,腫瘤細胞這一特殊生化表型,被稱為Warburg效應。因此,活躍的糖酵解代謝是惡性腫瘤細胞顯著的生化特征,是腫瘤細胞能量ATP的重要來源。臨床上已利用腫瘤細胞特異性的Warburg效應,通過正電子發(fā)射斷層顯像(positron emissiontomography,PET)

3、技術(shù)來診斷惡性腫瘤,而探索通過干預糖酵解代謝途徑來治療惡性腫瘤的策略正越來越受矚目。
　　 丙酮酸脫氫酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase,PDK)是細胞糖酵解關(guān)鍵限速酶丙酮酸脫氫酶(PDH)的調(diào)節(jié)酶。在人類和嚙齒類動物中目前鑒定出有4種PDK同工酶:PDKI、PDK2、PDK3以及PDK4。其中PDK1在心臟、胰島和骨骼肌中被檢測到微量表達,在PDH磷酸化過程中發(fā)揮重要的功能,尤其在PDH長期調(diào)節(jié)

4、中尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)PDK1的表達可被缺氧誘導因子HIF-1α調(diào)控,可能與腫瘤缺氧的環(huán)境有關(guān)。近年研究表明,PDK1除了具有糖代謝酶的催化活性,對細胞凋亡拮抗還有一定的影響,藥物抑制PDK1可誘導腫瘤細胞凋亡。體外細胞培養(yǎng)顯示,HIF-1α和PDK1在頭頸部癌、非小細胞肺癌、乳腺癌等細胞中表達增高。但HIF-1α和PDK1在人結(jié)腸癌組織中的表達和關(guān)系尚不清楚,PDK1在結(jié)腸癌中的表達、治療意義以及其相關(guān)作用機制還尚不明確。
　　

5、 化療作為結(jié)腸癌的重要治療手段,目前效果并不理想,尤其單藥化療已經(jīng)被聯(lián)合化療所取代。PDK-1蛋白兼有促進能量ATP合成和影響凋亡的雙重功能,因此推測PDK-1與結(jié)直腸癌化療有關(guān),抑制PDK1可能增強化療藥物的治療效果。
　　 線粒體功能的調(diào)節(jié)在細胞的生長、增殖、凋亡等過程中發(fā)揮重要的功能。以往研究表明,惡性腫瘤細胞中線粒體的結(jié)構(gòu)和功能均發(fā)生了一定的變化,線粒體膜結(jié)構(gòu)不完整,且糖酵解途徑獲能導致線粒體膜靜息電位高于正常,這些使得

6、惡性腫瘤細胞的增殖被促進而凋亡被抑制。相關(guān)研究指出抑制PDK1能改善結(jié)構(gòu)和功能,降低線粒體膜電位。但是這一效是否也是引起結(jié)直腸癌細胞增殖和凋亡的機制之一尚需實驗證實。
　　 本課題擬檢測HIF-1α和PDK1在人結(jié)腸癌組織中的表達,觀察HIF-1α與PDK1的關(guān)系;比較PDK1在正常組織和結(jié)腸癌組織中表達的區(qū)別與病理聯(lián)系,以期說明PDK1的表達與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。通過抑制PDK1,觀察結(jié)腸癌細胞增殖、化療藥物協(xié)同作用、凋亡相

7、關(guān)因子和線粒體結(jié)構(gòu)和功能的變化,以探討PDK1在結(jié)腸癌細胞增殖和化療中的作用及機制。
　　 方法
　　 1、通過免疫組織化學染色及免疫熒光雙標染色技術(shù)觀察結(jié)直腸癌組織標本中HIF-1α與PDK-1的表達和分布情況,了解二者在結(jié)直腸癌組織中表達的關(guān)系及與腫瘤分期、淋巴轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)的關(guān)系。
　　 2、采用RT-PCR、real-time PCR和免疫熒光、Western印跡法,檢測人結(jié)腸癌組織和4種人結(jié)腸癌細胞

8、株P(guān)DK-1基因和蛋白表達。
　　 3、應用MTT、BrdU摻入法、Hoeehst33258核染色及Annex-V雙染色法,觀察PDKl阻斷劑(Dichloroacetate,DCA)對結(jié)腸癌細胞活性、增殖、凋亡和化療的影響。
　　 4、通過流式細胞儀檢測線粒體膜電位(mitochondfia membrane voltage,△ψm)、胞內(nèi)鈣離子濃度,探討抑制PDK1與線粒體功能異常導致的細胞凋亡的關(guān)系。
　　

9、 5、在體內(nèi)實驗中,將LoVo細胞接種于裸鼠右側(cè)腋下,用PDK1抑制劑和兩種結(jié)腸癌常用化療藥物處理4周,測量皮下瘤體積并稱重,免疫組織化學染色法檢測腫瘤組織Caspase-3和PCNA表達。
　　 結(jié)果
　　 1、結(jié)直腸癌組織觀察到HIF-1α主要表達在腫瘤細胞的胞漿和(或)胞核,腫瘤壞死明顯的區(qū)域內(nèi)和腫瘤浸潤邊緣尤為多見,PDK1表達主要定位于腫瘤細胞的胞漿;HIF-1α的表達陽性率為78.04％,PDK1表達的陽性率

10、為76.20％,與癌旁結(jié)腸壁組織相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。二者的表達不受患者性別、年齡、腫瘤位置和腫瘤大小的影響(P＞0.05);低分化腫瘤HIF-1α與PDK1的陽性表達率高于高分化腫瘤(P＜0.05);腫瘤有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者HIF-1α與PDK1的陽性表達率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P＜0.05);隨著Dukes分期進展,HIF-1α與PDK1陽性表達率逐漸增高,C、D期表達情況較A、B期有顯著差異(P＜0.05);二者在結(jié)直腸癌

11、組織中的表達呈顯著正相關(guān)(Y=0.727,P＜0.01);免疫熒光雙標染色結(jié)果顯示HIF-1α與PDK1在結(jié)直腸癌組織中明確存在共表達現(xiàn)象。
　　 2、PDK1基因mRNA和蛋白在人結(jié)腸癌LS173T、LOVo、HT-29和SW620細胞中均明顯表達,其中LoVo細胞中表達最高。
　　 3、不同濃度(O-90mmol/L)DCA分別作用LoVo、LS174T、HT-29、SW620細胞48h,結(jié)腸癌細胞活性和增殖均受到明

12、顯抑制。小劑量DCA(2.5mmol/L、5 mmol/L)分別與化療藥物(5-FU和OXA)聯(lián)合作用LoVo細胞48h。檢測顯示,與5FU、OXA單獨作用LoVo細胞相比,聯(lián)合小劑量DCA對細胞活性和增殖的抑制作用更加明顯,數(shù)據(jù)分析后顯示小劑量DCA與5FU、OXA均有協(xié)同作用。
　　 4、流式細胞術(shù)檢測不同濃度(O-30mmol/L)DCA分別作用LoVo、LS174T、HT-29、SW620細胞48h,結(jié)腸癌細胞凋亡明顯增

13、加。小劑量DCA聯(lián)合5FIJ和OXA后凋亡細胞比例明顯高于5FU和OXA單獨作用,且具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。同時,在DCA作用下,LoVo細胞線粒體膜電位和胞內(nèi)鈣離子濃度均下降,且聯(lián)合5FU和OXA后下降效果更加明顯。
　　 5、裸鼠體內(nèi)實驗中,三組LoVo移植瘤分別用DCA、OXA及兩者聯(lián)合用藥處理后,皮下瘤平均體積和平均重量均明顯小于對照組移植瘤(P＜0.01)。與對照組比,三組藥物處理的LoVo細胞皮下瘤增殖指數(shù)顯

14、著下降,而凋亡指數(shù)則明顯升高。
　　 結(jié)論
　　 1、HIF-1α與PDK1在結(jié)腸癌組織中存在過表達和共表達現(xiàn)象,其表達不受患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小的影響,但在不同分化程度、不同Dukes分期和是否伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素中二者表達陽性率呈顯著差異,且二者表達呈顯著正相關(guān)。
　　 2、PDK1阻斷劑DCA可通過降低線粒體膜電位,增加線粒體膜通透性等機制來誘導結(jié)腸癌細胞凋亡。
　　 3、抑制PDKl可