虹鱒魚γ-INF誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶及LIGHT(TNFSF14)的克隆、表達(dá)及生物學(xué)活性研究.pdf

1、干擾素-γ誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶(GILT)在MHCⅡ抗原呈遞過(guò)程中起著還原二硫鍵的關(guān)鍵作用。LIGHT是TNF家族第14號(hào)成員，它在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、T細(xì)胞的共刺激、淋巴樣結(jié)構(gòu)的發(fā)生與發(fā)育、樹(shù)突狀細(xì)胞的活化等過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。本文運(yùn)用PCR、Real-time PCR、大腸桿菌原核表達(dá)、Westernbloting等分子生物學(xué)技術(shù)以及一些生物信息學(xué)方法，對(duì)虹鱒魚的GILT（rGILT）和LIGHT(rLIGHT)的核苷酸序列、氨

2、基酸序列、組織分布及重組蛋白部分生物學(xué)活性等方面進(jìn)行了分析和研究。結(jié)果如下:
　　1虹鱒魚GILT的克隆、表達(dá)以及活性研究
　　從虹鱒魚脾臟中提取RNA繼而擴(kuò)增得到虹鱒魚GILT基因(簡(jiǎn)稱rGILT)。rGILT的cDNA序列長(zhǎng)為762 bp，編碼253個(gè)氨基酸，蛋白分子量約為28.23 kDa，其理論等電點(diǎn)約為4.94。虹鱒魚GILT蛋白包含GILT蛋白的特征性結(jié)構(gòu)序列:CXXC基序和CQHGX2ECX2NX4C。且進(jìn)化分

3、析表明rGILT與其他物種的GILT起源于同一祖先。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，rGILT的表達(dá)具有組織特異性，并且經(jīng)過(guò)LPS刺激后，其在脾臟細(xì)胞和腎細(xì)胞中的表達(dá)量明顯上調(diào)，而虹鱒魚干擾素-γ（簡(jiǎn)稱rIFN-γ）在這些細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平也有類似趨勢(shì)。隨后在BL21(DE3)中表達(dá)了帶有His標(biāo)簽的pET28a-rGILT重組蛋白，并進(jìn)行了SDS-PAGE和Western Blot鑒定。最后，將人IgG抗體作為底物，我們測(cè)定了rGILT

4、的巰基還原酶活性。這些結(jié)果表明，rGILT能夠還原二硫鍵，對(duì)機(jī)體的天然免疫防護(hù)有重要作用，同時(shí)也為魚類免疫中GILT的角色提供新的研究依據(jù)。
　　2虹鱒魚LIGHT的克隆、可溶區(qū)表達(dá)和組織定量分析
　　本文選擇虹鱒魚作為研究對(duì)象，通過(guò)RT-PCR的方法從虹鱒魚的脾臟組織中擴(kuò)增得到開(kāi)放閱讀框?yàn)?17 bp的LIGHT基因，并對(duì)這個(gè)基因在不同物種中的同源關(guān)系進(jìn)行了進(jìn)化分析。通過(guò)Real-time PCR的方法對(duì)LIGHT基因在不